黄酮类物质测定-上海三黍生物科技有限公司

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黄酮类化合物以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。，本公司主要以槲皮素-3-氧-葡糖苷作为标样测定黄酮醇的含量。单宁单体主要为儿茶素等物质，公司已开发了针单宁单体的LC-MS检测平台，可精确测定各组分含量，重复性好，准确度高。
植物中的黄酮可以使植物适应陆地环境：防紫外线和氧化胁迫；种间相互作用（病原菌，共生），植物发育。在人体中，黄酮的功效也是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮可以改善血液循环，可以降低胆固醇，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。
　　黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。

　　在大多数植物中，黄酮骨架的生物合成起源于紧跟类黄酮合成分支的苯丙烷途径。

图2：黄酮生物合成途径。PAL: phenylalanine ammonia lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase; 4CL: p-coumaroyl-CoA ligase; 4CL-like: cinnamic acid specific CoA ligase; CHS: chalcone synthase; CHI: chalcone isomerase; FNS: flavone synthase; F2H: flavanone-2-hydroxylase; F3′H: flavanone-3′-hydroxylase; F6H: flavanone-6-hydroxylase; OGT: O-glycosyltransferase; FOMT: flavonoid O-methyltransferase; CGT: C-glycosyltransferase; RHM: UDP-rhamnose synthase.
Figure 2. Multiple and specialized flavone biosynthetic pathways. Purple path: Newly identified biosynthetic pathway for root-specific flavones in Scutellaria baicalensis. PAL: phenylalanine ammonia lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase; 4CL: p-coumaroyl-CoA ligase; 4CL-like: cinnamic acid specific CoA ligase; CHS: chalcone synthase; CHI: chalcone isomerase; FNS: flavone synthase; F2H: flavanone-2-hydroxylase; F3’H: flavanone-3’-hydroxylase; F6H: flavanone-6-hydroxylase; OGT: O-glycosyltransferase; FOMT: flavonoid O-methyltransferase; CGT: C-glycosyltransferase; RHM: UDP-rhamnose synthase.

　　植物中黄酮类化合物的相互分离以及单一黄酮成份的定量分析，常用高效液相色谱法(HPLC)法，对于总黄酮含量的测定，考虑到方法的快捷、简便和可行性等，主要采用在碱性介质中加铝盐显色的分光光度法。

　　1. 总黄酮测定：
　　AlCl3 法其反应原理: 黄酮母核上有3 - O H 和/或5 一 O H，B 环上有邻位二经基时( 这是黄酮类化合物的典型结构)，AlCl3可与之生成黄色的黄酮铝配合物，从而进行显色定量。AlCl3法测定时，芦丁、桑色素等黄酮类物质反应强烈，而对酚酸、原花色素的反应很小，因此该法对黄酮类化合物的专属性较强。
　　NaNO2 -Al(NO3)3 法其反应原理：酚羟基中的氧和铝产生黄色络合物，加入亚硝酸钠和氢氧化钠，在碱性条件下呈红色，在510nm处有最大吸收，反应显色在60min内稳定，源于芦丁含量测定法，并逐步用于黄酮类化合物的测定，后来发现这并不是黄酮类化合物的专属反应，因为凡具有也只有具有邻苯二轻基的物质，均能用此法进行显色定量。
　　因此，NaNO2 -Al(NO3)3法显色较为稳定，AlCl3法对黄酮类化合物的专属性较强，但又有自己的缺点，所以要根据测试样的特点具体进行选择。

　　2. 黄酮单体测定
　　对于常见的黄酮类化合物单体的定量分析可以用高效液相色谱法(HPLC)分析，以常见的黄酮类化合物卢丁、槲皮素、毛地黄黄酮、芹菜素、木犀草素等为标样进行定量分析。

图3. (1) rutin, (2) quercetin-3-glucoside, (3) quercitrin, (4) myricetin, (5) luteolin, (6) quercetin, (7) apigenin, (8) kaempferol, and (9) isorhamnetin

　　对于不常见或尚未有报道的黄酮种类，可以采用液质联用(HPLC-MS)分离与鉴定

图4: (a) Flavone profiles of transgenic leaves. (b) The MS/MS fragmentation patterns of peak f2. (c) The MS/MS fragmentation pattern of f4.

技术路线

技术优势：
• 高通量，一次可鉴定多种组分；
• 高灵敏度，下限低至1 ng；
• 检测方法多，可选用UPLC或者LC-MS;
• 重复性好，同批次样本RSD<2%;
• 方便快捷，可在一周内出结果；
• 服务周到，提供售前咨询、售后技术支持；

注意事项：
• 测试方法默认为公司常用方法，如果客户需要自己提供检测方法或者采用国标法，请提前告知。
• 需严格按照送样要求备样、取样和送样。
1 样品类型
植物鲜样、干样、液体样本等；

2 生物学重复
建议3次生物学重复；

3 样品需求量
鲜样：多余2 g
干样：多余1 g
液体样本：多余 2ml

4 样品准备
1，取样前需要设定好对照组、实验组，每组建议3次以上生物学重复。
2，鲜样取样时需要迅速，在时间上尽量保持一致；取材位置要统一，保证统一生理位置。
3，鲜样样品取材后要立刻液氮冷冻，干冰或-80度低温冷藏。干样常温存储和邮寄。
4，不建议客户做任何前处理，取材后寄给我公司即可。

5 保存和运输
样品请置于合适管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm 封口。建议在运输前将所有样品管固定于 50 ml 带盖离心管中，再将 50 ml 管放在封口袋中。干冰或冰袋运输，不能反复冻融。

6 样品标记要求
双标记，寄样管、寄样袋均写清楚样品编号；样本命名尽量避免简单的A/B/C或者1/2/3，建议客户采用字母加数字编号，避免重复；

7 其他
样品技术需求表务必随样品一起邮寄，由于表格信息不全造成的损失由客户。

序号	中文名称	英文名称
1	芹菜素	Apigenin
2	芹菜素7-O-葡糖苷酸	Apigenin 7-O-glucuronide
3	蓄苷、柳叶素	Avicularin
4	生物茶素	Biochanin A
5	紫花牡荆素	Casticin
6	大豆甙元	Daidzein
7	二氢莰	Dihydrokaempferol
8	二氢杨梅素	Dihydromyricetin
9	圣草次苷	Eriocitrin
10	圣草酚	Eriodictyol
11	金雀异黄素	Genistein
12	银杏黄酮混合物	Ginkgo Biloba Flavonoids Mix
13	绿茶儿茶素混合	Green Tea Catechin Mix
14	扁蓄苷\|	Guaiaverin
15	橙皮苷	Hesperidin
16	异荭草素	Isoorientin
17	异鼠李素	Isorhamnetin
18	异水飞蓟素A.	Isosilybin A
19	异水飞蓟素B	Isosilybin B
20	异牡荆	Isovitexin
21	山萘酚3-葡萄糖苷	Kaempferol 3-glucoside
22	木犀草素	Luteolin
23	杨梅素	Myricetin
24	柚皮素4'，7-二甲醚	Naringenin 4′,7-dimethyl ether
25	柚皮甙	Naringin
26	新橙皮甙	Neohesperidin
27	川陈皮素	Nobiletin
28	新橙皮苷二氢查尔酮	Neohesperidin dihydrochalcone