三黍生物

技术支持
首次在甘薯中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现淀粉

       甘薯(Ipomoea batatas)是世界上最富含淀粉的根系作物之一,也是人类营养和工业原料的来源。作为甘薯块根中最重要的组成部分:淀粉,主要由直链淀粉和支链淀粉组成。已有的文献已经证明,淀粉的生物合成需要五类核心酶,包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG),淀粉合酶(SS),淀粉分支酶(SBE),淀粉脱支酶(DBE)和颗粒结合淀粉合酶I(GBSSI),它们位于叶绿体或淀粉状体中。GBSSI负责直链淀粉的生物合成;SBE包括淀粉分支酶I(SBEI)和淀粉分支酶II(SBEII),负责支链淀粉的生物合成。高支链淀粉具有很好的粘度和口感体验;高直链淀粉相对于支链淀粉具有更好的工业性能和工业利用价值。已有的研究证明通过RNA干扰(RNAi)技术抑制GBSS基因,能够显著提高支链淀粉含量,形成蜡质淀粉;干扰SBE基因则可以显著提高直链淀粉的含量,获得高直链淀粉,但是会造成甘薯块根发育受损,减产严重。目前所有已知甘薯品系直链淀粉含量介于15%-30%之间,工业利用价值不高。



图 甘薯野生栽培种泰中6号和徐薯22号表型

       CRISPR/Cas9介导的基因组编辑是分子育种的革命性技术,已经成功对小麦、稻米、番茄、马铃薯等多种农作物进行了品质改良。然而,由于甘薯基因组庞大(2n = 6x = 90)、遗传背景复杂(六倍体)、自交不亲和、遗传转化困难等特性,使得甘薯基础研究严重滞后,新品种培育和品质改良十分困难。
       2019年9月23日,中国科学院分子植物科学卓越创新中心张鹏研究组在International Journal of Molecular Sciences杂志上在线发表了题为“CRISPR/Cas9-Based Mutagenesis of Starch Biosynthetic Genes in Sweet Potato (Ipomoea batatas) for the Improvement of Starch Quality”的研究论文。该研究首次利用CRISPR-Cas9技术在六倍体甘薯中实现了定点编辑,获得了高直链和蜡质淀粉,为食品加工及工业应用提供新型原材料, 也为今后甘薯的育种提供了新的思路和技术。我公司参与了该项目,市场部经理吴银亮为该文章并列一作。





       在本研究中,该团队选取了两个甘薯主栽品种:淀粉型品种“徐薯22”和富含类胡萝卜素的品种“泰中6号”( 图1)作为受体植物,针对淀粉生物合成途径基因IbGBSSIIbSBEII分别设计了两个sgRNA靶点,对应构建了单个和双个sgRNA靶点的CRISPR / Cas9载体(图1a,b,c)。在该载体系统中,sgRNA采用拟南芥U6启动子启动;Cas9蛋白采用UBQ启动子。终载表达载体采用pCAMBIA 1301S载体,带潮霉素筛选抗性。针对甘薯IbGBSSI基因,文章挑选了位于74-93bp处和292-311bp处作为特异靶点,两个靶点均位于基因第一个外显子上;IbSBEII基因选取了6814-6833bp处作为靶点1,位于第12个外显子上,第二个靶点位于第15个外显子(9471-9490bp)处。单靶系统只带有单一靶点;双靶系统带有2个特异性靶点。



图1 载体及sgRNA示意图

 
      在分别转化对应甘薯栽培种品系后,为验证基因编辑效率,故对转基因株系进行了分析。研究人员提取了转基因株系的基因组,首先通过Cas9基因扩增,验证株系的阳性与否。同时在在目的靶点上下游分别设计PCR扩增引物进行扩增,根据条带大小初步判定编辑效果:单带:可能发生点突变、移码突变或无突变;双带(一大一小):可能发生了大片段删除。分别回收对应PCR产物进行测序,对测序结果分析表明,CRISPR / Cas9系统在甘薯基因组中达到良好的基因编辑效果,突变率达到了63%以上(Table 1)。,在单靶体系和双靶体系中均发现了多种形式的编辑结果,如替换、插入突变、删除突变;在双靶体系中同时也检测到了大片段删除,最长可删除2658bp(图2,图3)。因为甘薯是异源六倍体,理论上存在六条独立染色体,为了弄清基因编辑的具体位置和效率,研究者又进一步对编辑位点进行了定位,通过多态位点分析,可以精确定位到编辑位点位于第几号染色体上(图4)。



图2 基因编辑分析示意图 


图3 基因编辑效果形式及定位


图4 编辑位点染色体定位分析  由图可知,1-24株系编辑位点位于2号染色体上

       为了更进一步验证目标基因编辑后的效果,研究者对淀粉理化性质进行了检测,发现虽然被编辑的植株总淀粉含量不变,但直链淀粉和支链淀粉的含量及链长发生了显著的变化(图5, 图6a, 6b)。其中GBSSI基因编辑的材料直链淀粉明显下降,支链淀粉含量上升;SBEII基因编辑的材料直链淀粉明显上升,支链对应下降(图5)。更进一步对链长分布进行分析,离子色谱分析结果显示,在GBSSI转基因材料中,短链有明显的增加,长链减少;对应的SBEII材料中,短链则明显减少,长链增加(Table 2,图6a);凝胶色谱对超长链进行分析,结果显示在DP200以后,SBEII基因编辑材料链长远高于野生型,GBSSI材料则相反(图6b)。


图5 直链淀粉含量结果


图6 链长分布结果

综上,该研究首次实现CRISPR/Cas9编辑甘薯淀粉合成基因改良了淀粉的品质,为今后甘薯分子育种及多倍体作物基因编辑提供了新方向。
文章链接:https://www.mdpi.com/1422-0067/20/19/4702