行业动态

玉米籽粒

RNA测序，蛋白质组，金属离子检测，可溶性糖检测，淀粉含量测定，总蛋白含量测定，RNA原位杂交，免疫印迹检测，双荧光素酶报告反应，DAP-seq，pull-down，Co-ip，BiFC，LCI，qRT-PCR，ChIP-qPCR，EMSA等。

1、 ZmNAC128和ZmNAC130对胚乳充实至关重要

先前的研究中表明，ZmNAC128和ZmNAC130被RNAi干扰后，植株的千粒重降低了30%。因此，作者根据CRISPR Cas9技术获得了不同的突变体，单突变体与野生型的籽粒表型相似，双突变体均表现除不饱满籽粒的表型，作者选取了单突变体zmnac128、zmnac130和双突变体zmnac128 zmnac130进行了后续的研究。

对籽粒纵切观察后发现，zmnac128 zmnac130的胚乳内有一个空洞，外围胚乳变得絮状，而单突变体zmnac128和zmnac130的果仁表型与WT相同，且扫描电子显微镜（SEM）观察表明，zmnac128 zmnac130胚乳中的淀粉颗粒（SG）比WT小（图1A）。从百粒重（HKW）上来看，zmnac128 zmnac130的比WT低56.8%，而单突变体没有显著降低（图1B）。近红外光谱的分析结果表明，单突变体中的淀粉和蛋白质含量略有降低，而双突变体的中蛋白质和淀粉的含量降低了50%以上

上述结果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在促进胚乳充实方面具有冗余作用，同时失去时会严重影响贮藏储备的积累。

图1 ZmNAC128和ZmNAC130突变导致籽粒填充不良

2、 RNA-seq结合DAP-seq进行ZmNAC128和ZmNAC130的功能解析

为了研究基因调控网络，作者取胚乳进行了RNA-seq分析，单突变株分别仅有80和2个差异基因（DEG），而双突变株中存在2686个DEGs（图2A）。在DEGs的富集结果中观察到两个GO条目，其中GO0045735是营养库活性，主要包括玉米蛋白家族基因，此外，多种碳水化合物代谢相关通路也被富集（图2B）。上述结果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在玉米蛋白和淀粉的生物合成中起着关键作用。

DAP-seq测定结果表明，两种NAC结合的所有峰中约有60%位于距转录起始位点（TSS）约3kb的基因区，其中40%以上位于TSS的1kb范围内（图2C）。进一步分析表明，峰值主要集中在紧靠TSS的上游（图2D），这与ZmNAC128和ZmNAC130作为TFs的功能相一致。通过IGV进行可视化分析后，在16-kD γ-zein和Bt2的启动子中，鉴定出的顺式元件ACGCAA被ZmNAC128和ZmNAC130的结合峰所包围（图2E），利用MEME-ChIP工具探索后发现ZmNAC128和ZmNAC130结合的最重要顺式元件也是ACGCAA。

图2 RNA-seq联合DAP-seq研究ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶点

此外，作者在另外两个γ-zein（27-kD和50-kD）的启动子中观察到了与ZmNAC128和ZmNAC130结合相应的峰值，启动子起始密码子上游结合峰区周围检测到了保守基序ACGCAA（图3A）。为了检测ZmNAC128和ZmNAC130与两个启动子中含有ACGCAA的片段的结合情况，作者随后进行了ChIP-qPCR检测，如图3B所示，结果证明结合关系的确存在。后续的双荧光素酶报告实验的验证中，ZmNAC128或ZmNAC130显著提高了两个启动子的活性（图3C）。

上述结果表明，ZmNAC128和ZmNAC130在淀粉和蛋白的累积中起重要作用。

图3 27-kD γ-zein和50-kD γ-zein是ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶点

3、 ZmNAC128和ZmNAC130直接调控多个重要淀粉代谢基因的表达

为了检测ZmNAC128和ZmNAC130对淀粉代谢的影响，作者对主要淀粉代谢酶蛋白进行了一系列免疫印迹检测（图4A）。结果表明，与WT相比，zmnac128 zmnac130中相应的蛋白质积累也减少了近80%，四种淀粉生物合成酶（包括GBSS1、SS1、SSIIa和ISA1）的积累也减少了50%以上。这些结果表明，几乎所有检测到的蛋白质在双突变株中都有所降低，淀粉含量和粒重显著降低的主要原因之一。进一步的分子分析表明，除Bt2外，另外五个基因（Zpu1、GBSS1、SS1、SSIIa和Sus1）的启动子也含有保守顺式元件ACGCAA（图4B），ChIP-qPCR和双荧光素酶实验进一步验证了ZmNAC128和ZmNAC130与这五个基因启动子的结合关系（图4C-D）。

上述结果表明，ZmNAC128和ZmNAC130通过直接调控这些淀粉代谢基因，发挥了淀粉代谢核心TF的功能。

图4 淀粉代谢基因作为ZmNAC128和ZmNAC130的直接靶点

4、  ZmNAC128和ZmNAC130直接调控O2的表达

Opaque2（O2）是与玉米蛋白生物合成相关的转录因子，在已知的胚乳填充相关TF基因中，O2、ZmNAC128和ZmNAC130在填充期胚乳中的表达量最高。RT-qPCR分析表明，在整个灌浆期，Zmnac128 Zmnac130胚乳中O2的转录水平平均下降了近50%，蛋白积累也显著减少了60%-80%（图5A-B），这证明ZmNAC128和ZmNAC130在整个灌浆期有维持胚乳中O2高表达的作用。

为了确认ZmNAC128和ZmNAC130是否直接调控O2的表达，作者检查了DAP-seq数据，O2启动子中出现了结合区域相对应的明显峰值，随后通过电泳迁移试验（EMSA）确定具体候选基因，探针覆盖了O2基因起始密码子上游-510到-360bp的151bp区域，P3片段结合形成延迟带，ChIP-qPCR也说明了这种结合关系（图5D-E）。最后，进行了双荧光素酶报告反应验证了ZmNAC128或ZmNAC130显著提高了O2启动子驱动的LUC活性（图5F）。

这些结果表明，这两种NAC在直接激活O2的高表达方面发挥了关键作用。

图5 ZmNAC128和ZmNAC130调控灌浆胚乳中O2的表达

5、 三种转录因子的物理相互作用

为了检测三种TF之间的相互作用，作者进行了一系列体外和体内蛋白质-蛋白质相互作用检测：pull-down，BiFC，LCI和Co-IP（图6A-C）。结果表明，ZmNAC128与O2、ZmNAC130和自身相互作用，而ZmNAC130与ZmNAC128和自身相互作用。

图6 体外和体内实验显示O2、ZmNAC128和ZmNAC130之间存在相互作用

6、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2的联合调控效应

为了研究这三种TF对胚乳填充的综合影响，作者构建了一个zmnac128 zmnac130 o2三重突变体。与双重突变体相比，三重突变后的籽粒表型更不饱满，百粒重有所降低，淀粉含量和蛋白质含量均降低（图7A-C）。

图7 O2、ZmNAC128和ZmNAC130的三重突变导致更差的籽粒表型

进一步的RNA-seq分析表明，与o2相比，zmnac128 zmnac130 o2 的转录组与zmnac128 zmnac130的转录组更为相似，zmnac128 zmnac130 o2 的DEGs数量略高于zmnac128 zmnac130，但比o2高两倍，DEGs的Venn图展示出，超过60%的DEGs在zmnac128 zmnac130 o2和zmnac128 zmnac130之间共享（图8A-C），这表明Zmnac128和Zmnac130对胚乳填充的影响强于O2。在针对三种突变体共有的DEGs进行分析时，营养库活性是最显著的GO条目，与对玉米素家族基因表达的强烈影响是一致的。库马西亮蓝染色显示，除了27-kDγ-zein外，大多数玉米蛋白几乎不可见（图8D）。此外，大多数淀粉代谢基因和其他碳水化合物代谢基因在zmnac128 zmnac130 o2、zmnac128 zmnac130和o2中被下调至相似程度，免疫印迹分析的结果表明，相关基因的蛋白水平表达量也有所降低（图8E）。

图8 O2、ZmNAC128和ZmNAC130协同影响玉米蛋白和淀粉代谢酶的表达

7、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2调控BETL中关键转运基因的表达

RNA原位杂交结果显示，ZmNAC128和ZmNAC130不仅在淀粉胚乳（SE）中表达，而且在胚乳基底转移层（BETL）中表达(图9A)。转录数据表明，与WT相比，ZmSWEET4c、ZmSUGCARI、ZmYSL2和ZmMNI的表达在zmnac128 zmnac130中均显著下调（图9B），DAP-seq中，ZmSWEET4c和ZmSUGCAR的启动子中存在与ZmNAC128和ZmNAC130结合区域对应的峰，ChIP-qPCR显示出了一样的结果。双荧光素酶实验表明，仅ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的活性被激活，且与单突变相比，双突变并无显著差别（图9C-E）。

图9 ZmNAC128和ZmNAC130调控ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的表达

8、  ZmNAC128、ZmNAC130和O2对糖和营养吸收的影响

为了确认3个核心TFs的突变是否影响籽粒营养物质的吸收，作者成熟干粒中的可溶性糖和运输元素的含量，结果表明，与对照组相比，o2的葡萄糖、果糖和蔗糖水平显著增加，zmnac128 zmnac130中的蔗糖水平明显下降，而zmnac128 zmnac130 o2中这三种可溶性糖的水平要比zmnac128 zmnac130和o2高很多。上述数据反映了三个核心TF在淀粉合成中的重要性，ZmNAC128和ZmNAC130的功能缺失突变确实影响了籽粒对糖分的吸收，尤其是对蔗糖的吸收。

在元素水平上，与o2相比，zmnac128 zmnac130的钾含量显著降低，但与对照组相比无显著差异；而在锌水平上，zmnac128 zmnac130比o2和对照均显著降低；铁水平无显著变化。

综上，O2、ZmNAC128和ZmNAC130可能部分通过调节ZmSWEET4c、ZmSUGCAR1和ZmYSL2的表达来影响可溶性糖、锌和钾的吸收。

图 10 O2、ZmNAC128和ZmNAC130的突变影响籽粒中可溶性糖和元素的水平

【小结】

在这项研究中，作者利用RNA-seq，蛋白组检测，双荧光素酶报告反应，免疫印迹检测等手段，发现了在玉米籽粒的发育过程中，ZmNAC128和ZmNAC130与O2相互配合，从BETL的营养吸收到SE的淀粉及玉米蛋白合成，促进胚乳充实，同时调节自身的表达。该发现极大地拓宽了对谷粒充实的认识，对提高谷物的充实效率具有潜在的重要意义。

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