研究背景
茶作为一种非酒精饮料，含有丰富的次生代谢物，其中黄酮苷约占新鲜茶叶中茶多酚总量的13%，它具有许多显著的健康益处，如抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用。类黄酮苷是典型的苦味和涩味化合物，有助于茶饮料的味道。然而，在茶树中促进苦味化合物（如黄酮类化合物7-O-新橙皮糖苷）生物合成的基因尚未确定。2022年2月Journal of Agricultural and Food Chemistry在线一篇题为“Two UDP-Glycosyltransferases Catalyze the Biosynthesis of Bitter Flavonoid 7-O-Neohesperidoside through Sequential Glycosylation in Tea Plants” 的研究论文。该研究确定两种UDP糖基转移酶（类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶和7-O-葡萄糖苷-1,2-鼠李糖基转移酶）通过糖基化催化类黄酮7-O-新橙皮糖苷的生物合成，该研究为控制茶的苦味和涩味提供了关键的分子标记。
02
材料方法
植物材料和标准品
基因组的序列分析和克隆
rCsUGTs的异源表达与纯化
酶法测定rCsRHMb和RCSUGT
代谢物提取
LC-MS/MS分析
基因表达分析
亚细胞定位
03
研究路线
04
研究结果
1. C. sinensis.中CsUGTs的鉴定及系统发育分析
研究搜索茶树中转录组数据确定了178个CsUGT基因，对其转录水平的分层聚类分析表明，这些基因分为四种表达模式（图2），在不同的组织中发挥糖基化功能。系统发育分析结果表明，CsUGT79B28可能具有分支形成糖基转移酶活性，并催化以单糖为底物的糖基化第二步生成类黄酮二糖苷。
图2 不同组织UGT基因转录层次聚类分析
图3 参与类黄酮二糖苷生物合成候选基因CsUGT的系统发育分析。
2. CsRHMb和CsUGT75L12的酶学特性
使用MBP标签纯化系统纯化重组CsRHMb（rCsRHMb）和CsUGT75L12（rCsUGT75L12）蛋白。酶分析结果表明，CsRHMb在体外选择性催化UDP-glc转化为UDP-rah（图4B）。分别使用黄酮类化合物和UDP-glc作为糖受体和供体对rCsUGT75L12蛋白进行初始酶活性测定，分析表明，rCsUGT75L12对以UDP-glc为糖供体的七种黄酮类化合物均具有活性，在黄酮类化合物的7-OH位置上具有葡萄糖基转移酶活性，并对糖受体表现出广泛的底物特异性，产生相应的类黄酮7-O-葡萄糖苷。
图4 CsRHMb、CsUGT75L12和CsUGT79B28的生化特性
3. CsUGT79B28催化类黄酮7-O-二糖苷生物合成
为了确定CsUGT79B28是否负责鼠李糖基化的第二步，该步骤涉及将类黄酮单糖苷转化为类黄酮7-O-二糖苷，体外分别以UDP-rha和类黄酮7-O-糖苷作为糖供体和受体，酶分析rCsUGT79B28蛋白，结果表明，rCsUGT79B28特异性催化类黄酮7-O-葡萄糖苷的C-2′位置，从而产生类黄酮7-O-新橙皮苷。
图5 不同底物下重组CsUGT75L12和CsUGT79B28蛋白的活性筛选
4. 重组酶的生化特性
为了表征两种蛋白质rCsUGT75L12和rCsUGT79B28的酶学性质，通过测量相对酶活性来确定最佳反应pH和温度。结果表明，在茶树中，rCsUGT75L12和rCsUGT79B28蛋白都可能在不同的pH条件下进行糖基化，CsUGT75L12和CsUGT79B28催化黄酮类化合物的顺序糖基化和鼠李糖基化，产生类黄酮7-O-新橙皮苷。
图6 rCsUGT75L12和rCsUGT79B28反应条件的优化
5. CsUGTs的基因表达及黄酮苷的代谢产物谱
研究通过质谱确定了化合物柚皮素7-O-葡萄糖苷和柚皮素7-O-新橙皮苷化合物（图7A）。qRT-PCR和LC-MS/MS分析，分别测定了茶树不同组织中的代谢物，以及柚皮素7-O-葡萄糖苷和柚皮素7-O-新橙皮苷的表达水平和积累模式，结果表明CsUGT75L12和CsUGT79B28表现出相似的表达谱，并在不同茶组织中高度表达（图7B）。对三种基因CsUGT75L12、CsUGT79B28和CsRhMb瞬时表达的研究，三种蛋白质表现出相似的表达谱，位于叶细胞的细胞质和细胞核中（图7D）。
图7 CsUGTs的基因表达和类黄酮苷的代谢产物谱
05
小结
该研究确认了两种化合物通过黄酮类化合物的连续糖基化和鼠李糖基化参与黄烷酮7-O-新橙皮苷的生物合成。该发现不仅为茶树类黄酮二糖苷代谢提供了分子见解，而且为控制茶的苦味和涩味提供了关键的分子标记。
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