2021年11月，佛罗里达农工大学Protiva Rani Das团队在Food Chemistry（IF 7.514）上发表了题为”Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。通过8个蓝莓品种在三个发育阶段的总代谢物含量、抗氧化、抗癌活性和非靶向代谢物谱分析，为后续的研究提供了一个全面的蓝莓生物活性代谢物和生物活性的类型、相对数量和积累模式的数据库，对食品和保健品行业的发展具有指导意义。
以思维导读形式呈现
1.1蓝莓各阶段总代谢产物含量及抗氧化活性
通过总酚含量(TPC)、总黄酮含量(TFC)、总花青素含量(TAC)、DPPH自由基清除活性和FRAP抗氧化活性的测定，得到各个阶段蓝莓的总代谢产物含量和抗氧化活性。
研究发现各生育期及各品种蓝莓的代谢物及抗氧化活性差异较大，总体而言大多数品种在发育第一阶段的TPC、TFC及TAC含量显著高于第二和第三阶段，但是他们的积累方式是不一样的。通过DPPH和FRAP测定蓝莓提取物的抗氧化潜力并结合TPC和TFC结果得知，不同品种和发育阶段TPC和TFC的变化伴随着抗氧化活性的差异。在研究的8个品种中，Vernon品种具有更高的TPC、TFC及TAC的水平。
图1. 不同蓝莓品种在不同发育阶段的(A)表型、(B) 总酚含量 (TPC)、(C) 总黄酮含量 (TFC)、(D) 总花青素含量 (TAC)、(E) DPPH 自由基清除活性和 (F) FRAP 活性研究
1.2蓝莓提取物对癌细胞生长的抑制作用
测定了不同品种和不同发育阶段的蓝莓不同浓度的提取物对癌细胞活性的影响(表1).结果表明蓝莓提取物的抗癌活性与剂量和孵育时间有关，并且提取物在250 ~ 500 ng/mL范围对三种细胞的生长均有显著的抑制效果。
选取了抗癌活性最高的Vernon和最低的Star蓝莓品种，进一步研究了蓝莓提取物的潜在抗癌活性。结果表明，Vernon在发育阶段I中抗癌活性最强，这可能与其具有较高的生物活性代谢物含量有关。（图2）
图2. (A)选定的蓝莓品种在不同发育阶段，在500 ng/mL剂量下孵育48 h，对A549、HepG2和Caco-2癌细胞生长的抑制率(%)。(B)选定的蓝莓品种在整个发育阶段对(B) A549， (C) HepG2和(D) Caco-2癌细胞48小时的IC50值。
1.3非靶代谢分析
选取具代表性的品种Vernon和Star进行代谢组学分析（图3）。共检测出328种代谢物，基于代谢物集富集分析(MSEA)分析可知，P值较高的主要化学基团为氨基酸和多肽、脂肪酸和共轭物、三羧酸、有机羧酸等。
通过PCA图分析可知相较于发育的阶段差异，品种间的差异主要影响了蓝莓代谢产物的差异（图4）。火山图结果可知在Vernon的每个发育阶段这三种常见代谢物epiafzelechin 3-gallate、lucuminic acid和naringin都显著上调。相比之下，各阶段下调的代谢产物如没食子酸、曲酸、2,5-呋喃二甲酸、5-羟基-2-糠酸等物质较为常见（图4）。
图3.代谢物集富集分析(MSEA)图
图4. PCA和柱形图分析（展示火山图前20种 FC 代谢物模式）
1.4生物标志物代谢物的筛选及其与抗癌活性的相关性
对Vernon和Star的328个已鉴定的蓝莓代谢物进行 PLS-DA分析，根据不同的重要度(VIP>1)评分获得17个生物标志物代谢物，包括其中奎宁酸、甲基琥珀酸、柠檬酸、草酸、苹果酸、氧戊二酸、赖氨酸等。
进一步对鉴定得到的生物标志物化合物和抗癌活性进行热图分析，结果表明蓝莓代谢产物的相对含量和抗癌性在不同品种间存在明显的差异。与Star相比，Vernon品种具有更高的抗癌活性，这可能是因其所鉴定的生物标志物含量更高（图5）。通过对 17 种生物标志物的抗癌活性进行了相关性分析，结果筛选出绿原酸、氧代己二酸、奎尼酸、甲基琥珀酸和苹果酸这5种具有较高抗癌潜力的代谢物，与此同时， Vernon品种在每个发育阶段包含的每种生物标志物的相对含量显著较高（图6）。
图5. PLS-DA分析图以及抗癌活性的热图VIP (≥1.0)
图6. 生物标志物的筛选及相关性分析
作者对不同品种不同发育阶段的蓝莓果实进行了总代谢物、抗氧化活性、抗癌潜力和非靶代谢组研究，发现品种差异是导致蓝莓提取物之间差异的主要原因。多元统计分析确定了五种与抗癌活性呈较高正相关的生物标志物包括奎尼酸、甲基琥珀酸、绿原酸、氧代己二酸和苹果酸。且证实，相对于其他阶段，发育阶段 I（未成熟）的蓝莓果实含有更高的酚类物质和类黄酮含量以及更高的抗氧化和抗癌活性。本研究中鉴定的生物标志物及其证明的抗癌活性预计对食品、制药、营养保健品等领域具有重要价值，对开发具有抗癌潜力的新蓝莓种质具有深远影响。
