苜蓿是一种广泛培养的耐盐、双用途作物，因其丰富和高质量的PS（植物多糖）而被广泛用作食品和饲料，而PS是植物的主要代谢物，参与了细胞壁的形成。有前期研究表明，苜蓿(APS)的PS主要由GalA（57.11%）、Glc（16.42%）和Ara（6.19%）组成，具有抗氧化和免疫调节生物活性。其中Ara是一种生态敏感分子，其在植物的合成中受到生态和环境条件的影响。Ara的生物合成被证明是拟南芥抗盐胁迫的关键途径，土壤盐度是最常见的非生物胁迫信号，可以通过触发细胞内成分的生物合成来增强植物的耐逆能力。然而，盐碱土对苜蓿PS组成和生物活性的影响机制尚不清楚。因此，研究盐碱土对APS结构特性的影响，对于靶向分离和具有所需生物活性的功能性PS的应用具有至关重要的意义
2022年5月24日，山东农业大学张桂国团队在Food Function（IF=6.317）杂志上发表题为“Influence of the ecological environment on the structural characteristics and bioactivities of polysaccharides from alfalfa”的研究论文。该论文解析了来源于正常土壤APS1和盐碱土壤APS2多糖结构，并研究了其细胞毒性及抗成脂作用。可知，生态环境影响了APS的结构特征和生物功能，使其成为通过功能性食品抗成脂的潜在候选者，这些研究结果为考虑生长环境条件来选择具有特殊生物活性的植物源性多糖提供了一个新的视角。多糖的结构解析部分由我司完成。
研究材料
正常土壤苜蓿（APS1） 盐碱地土壤苜蓿(APS2)
实验路线
研究结果
1 APS的微观形态和单糖组成
图1 两种APS的电镜扫描图像
图2 两种APS的单糖检测
在本研究中，APS1和APS2均表现出明显的聚集和沉淀特征，APS粉质地均匀，表面平坦。分解外表面后，在电镜扫描下可以观察到交联网络或蜂窝状微观结构。单糖组成分析可得，两种APS类型中均存在7种单糖和2种糖醛酸， 主要成分为Ara、Gal和GalA，两种APS含有相同的单糖组成但含量略有不同。(图1-2)
2 APS的红外光谱及分子量结果
图3 两种APS傅里叶变换-红外光谱
从图中可知：APS1和APS2的透光光谱相似，但变化较小，波数主要分布在400~4000cm-1之间。APS在2917cm-1处1609cm-1处以及1424cm-1处和10801cm-1均有糖类的特征吸收。
表2不同APS的分子量、多分散性和均方根
图4. APS的绝对分子量和分子构型图
APS的摩尔质量、变化趋势和构象特征如表2和图4所示。从表中可以看出APS1的摩尔质量更大但质量变化范围更小。APS1构象图的斜率小于APS2，说明APS1和APS2与高度分支化的植物大分子均表现出复杂的交联。（表2 图4）
3 APS的糖苷键与核磁结果
表3 两种APS糖类残基之间的糖苷键及其摩尔比例
GCMS分析结果表明，APS1和APS2分别有9个和7个不同的糖苷残基，主要由GalA、Ara、Gal和Glc组成。APS2的Ara和GalA残基比显著高于APS1.这一发现进一步证实了Ara 和GalA是生态敏感成分，且苜蓿在盐碱胁迫下的二者合成得到增强 。
图5 两种APS的核磁共振(NMR)图谱
通过核磁共振分析进一步研究了APS1和APS2中糖基残基之间的关系，包括一维1H，13C 和以及二维HSQC、COSY、HMBC和NOESY谱。通过核磁图谱的分析，其重复单元如表4所示。
表4.APS的糖残基化学归属
图6 两种APS的重复单元和分子构象
通过上述结构参数，预测了APS1和APS2潜在的三维分子结构。APS1和APS2的重复单元均由Gal、GalA、Glc和Ara组成，单摩尔比略有不同。结合分子量结果，可以推断APS1和APS2分别包含41和22个重复单元，说明两者都是长链大分子。
此外，三维空间结构功能结果显示，APS1和APS2的重复单元紧密相连，且高度分支通过透射电镜检测了APS1和APS2的整体形状轮廓和空间构象，APS1展开的部分分子表现出具有分支结构的交联网或网格模式，而APS2在SDS溶液中似乎是一个随机线圈。（图6）
4 APS1和APS2的细胞毒性和抗成脂作用
图7 APS在3T3-L1细胞中的抗成脂作用及其潜在机制
APS1和 APS2处理均能显著抑制3T3L1细胞的脂肪生成和脂质积累且APS2作用优于APS1。
接着，作者评估了在3T3-L1细胞中，APS处理后脂肪细胞标记基因的转录调控。得到脂肪细胞的分化的过程不仅与细胞内脂质积累有关，还与各种转录因子的调控有关，特别是Pparγ和C/ebpα被认为是分化过程中高表达的主调控因子。此外，它们还被认为是脂肪细胞中多种蛋白质的表达调节因子。与未处理组相比，APS1和APS2均有效降低了Pparγ、 C/ebpα和Fas的mRNA表达水平。（图7）
总结
综上所述，在APS1和APS2分子中分别鉴定出不同比例的的9种单糖类型。其中APS2的Ara和GalA含量高于APS1，APS1的摩尔质量比APS2大，但APS2的摩尔质量分布范围更大。APS1和APS2均通过下调Pparγ、C/ebpα和Fas的mRNA表达水平，显著抑制3T3-L1细胞的脂肪生成和脂质积累，而且APS2具有更强的抗成脂作用。因此，APS可能是一种对抗肥胖的药物或功能性食品的潜在候选药物，这些发现也为具有特定生物活性植物源性PS的靶向分离提供了一个科学的视角。
三黍多糖项目
