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2023.06.16

文献解读

文献解读|宫颈癌进程的新见解——单细胞核转录组与蛋白质组学的联合发现

背景

宫颈癌（Cervical cancer ，CC）

是女性第三大最常见的癌症，也是妇科恶性肿瘤的第四大死因，然而CC的确切进展并无定论，主要是因为在肿瘤发生的不同阶段，肿瘤微环境的变化非常复杂，且目前还缺乏对不同阶段CC患者的肿瘤微环境进行详细的单核转录组比较分析。

2023年1月发表在J Exp Clin Cancer Res上的题为“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer”的论文，通过对CC I期和CC II期的肿瘤样本进行单核转录组和定量蛋白质组学分析，发现CC II中免疫应答相关信号被抑制，TNF-α和γ反应是CC I许多细胞群中最活跃的途径，此外，几种胶原蛋白在CCII组中被发现显着上调，一种新的转录本AC244205.1被检测为CCII患者中上调最多的基因。

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研究材料

四名CC I期患者和三名CC II期患者的肿瘤样本

技术方法

单细胞核转录组，蛋白质组学

实验路线

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研究结果

鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成

作者首先从I期（n=4）和II期（n=3）供体的肿瘤组织中分理出细胞核进行了snRNA-seq，共有72,128个核被用于后续分析（图1A-B），结果中显示了22种细胞类型，通过结果比对发现CC II组中第3、4、9、14、15、16、17、18、19群的比例基本增加，而第2、5、7和20群的比例减少，群组0和3的许多细胞没有显示明确的细胞周期标记基因的差异表达（图1C-D）。随后作者对整体差异表达的基因进行分析，确定细胞类型特异的标记基因（图1E）。

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图1 CC I期和CC II期宫颈癌患者肿瘤组织的snRNA-seq分析

免疫抑制和促进肿瘤生长的表型在CC II患者TME的巨噬细胞中占主导地位

基因表达结果显示，CC II组中有122个上调和102个下调的差异基因，MΦ标记基因的表达在CC II组中相对下调。许多趋化因子、细胞因子和白细胞介素在CCI组显著高表达，包括M1样MΦ的特征因子，如IL12RB1、IL2RA和IL20RB。与免疫抑制性MΦs相关的基因在CC II组中升高。根据途径分析结果，上皮-间质转化（EMT）是CC II组中最丰富的途径，由胶原蛋白家族成员的上调支持（图2A-D）。此外，P53途径、通过NFκB的TNF-α信号和细胞凋亡途径均在CC II组中被检测到富集，与细胞骨架的发展相关的几个途径也是如此。CC I组中编码干扰素诱导蛋白的基因的升高支持了IFN-α和IFN-β反应途径的激活（图2E）。

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图2 CC I和CC II组的MΦs显示出不同水平的免疫反应

作者对MΦ亚型进行分析后确定了5个亚型，分别为C0-Res、C1-TAM、C2-M2、C4-M1和C2-M2，差异基因表达情况如图3A所示。通过比较各亚型中与巨噬细胞功能相关基因的平均表达水平，发现STAT1、HLA-DRB1、TMSB4X、C1QC和FGL2在CC I组的所有亚型中都有较高的表达比例（图3B）。随后将MΦ投射到Monocle3定义的二维状态空间上进行伪时序分析，推断MΦ发展的线状轨迹（图3C），结果显示该轨迹从C0-Res和C2-M2开始，向不同的方向发展，一个方向通向C3-DC和C4-M1，另一个方向与C1-TAM相连，其分支由C1-TAM、C3-DC和C4-M1组成。

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图3 CCI组和CCII组巨噬细胞异质性分析

CC II患者TME中的T细胞功能被抑制

有三种细胞群被鉴定到，分别为CD8+T、γδT和Treg细胞。CD8+T和γδT细胞的数量在不同阶段有很大的变化，前者从57%（CC I）增加到80%（CC II），而后者减少了近70%，CC I组患者的Treg细胞数量高于CCII组（图4A-B）。两组之间三种T细胞群的分布显示在2D-tSNE空间中，CD8+T细胞分为五个主要亚型（a、b、c、d和e），其中CC II组的a亚型细胞数量明显较多，CC I组有更多来自b、c、d和e亚型的细胞。CD8A和PRF1在CD8+T的d亚群中高表达，而高表达CD4和CTLA4的细胞主要在CC I组的Treg细胞中检测到。IFNGR1和IFNGR2在γδT细胞中表达较多，而IFIT3在CCI组的Treg细胞中表达上调（图4C）。

三个T细胞群的Top100差异基因如图4D所示，与激活T细胞免疫反应相关的基因在CC I组的CD8+T中明显上调，与干扰素反应密切相关基因在CC I的γδT细胞中被上调，与抗原呈递有关的CD38和CD48的表达在CD8+T和Treg细胞中升高，但在CC I组的γδT细胞中下调。这些观察结果表明，与CC I组相比，CC II组的T细胞更具有免疫抑制性。

图4 CC II组患者的T细胞活化较少

CC II中的B细胞和DCs的MHC-I类抗原过程被抑制

CC I组有更多的浆细胞样树突状细胞（pDCs），而B细胞在CC II组更丰富（图5A）。对于CD141+CLECL9A+ DCs 和 pDCs来说，与抗原呈递相关的差异基因在CC I组中被上调，而CC II组的HLA-B、HLA-A、HLA-C和HLA-DMB的平均表达量更高（图5B）。生物过程分析结果表明，组织发育信号在CC II组的DCs中被高度激活，但比较与MHC-I类抗原处理相关的差异基因表达表达情况时，发现它们在CCI组的B细胞中被上调（图5C-D）。CC II组的先天B细胞中COL3A1、COLA1和COLA2被上调（图5E）。与I型和II型干扰素信号相关的基因在CC I组的B细胞中被上调，IL-18的信号和趋化因子的活性在CC II组的先天B细胞中升高。

图片7.png 图5 CC I组TME中的B细胞和DCs表现出增强的MHC-I途径

NK细胞在CC I组中更活化

KEGG的富集结果显示，CC I组的大多数NK细胞表达了更高水平和激活的NK细胞功能正相关的标记基因，调节IL17和TNF信号的基因被CC II组的NK细胞高度表达（图6A）。GZMA、KLRC1、GZMB和NKG7仅在CC II组的少数NK细胞中表达（图6B），与趋化因子和细胞因子信号相关的DEGs在CC I组的平均表达量和表达百分比大多升高（图6C），GSEA结果表明 "自然杀伤细胞介导的细胞毒性 "是CC I组唯一富集的KEGG途径（图6D）。

作者随后分析了NK细胞的亚型，结果显示CC I组拥有更多的成熟（标记基因PRF1、GZMA、GZMB和CFL1）、CD56bright（KLRC1、NCAM1和GNLY）和末端（WDR74、HIST1H1D和HIST1H1E）NK细胞（图6E）。两组NK细胞的发展是根据轨迹分析推断出来的，共确定了七种状态，在CC I组检测到的成熟NK细胞比例较高（图6F-G），终端NK细胞的比例在状态1中是第二大的，然后在状态2和状态7中随着时间的推移而减少，而过渡性NK细胞的比例增加。状态6主要由CD56bright和成熟NK细胞组成。与CC II组相比，CC I组所有状态下的标记基因的表达都明显上调，除了状态5（只包含成熟NK）（图6H）。

因此，在免疫反应方面，CC I的NK细胞相对于CC II组更活跃。

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图6 NK细胞的功能在CC II患者的TME中受到抑制

CC I和CC II患者的癌细胞呈明显的异质性

肿瘤干细胞（CSCs）的比例在CC II组为24.75%，而在CC I组只有15.63%。所选标记基因的相对表达密度显示在二维tSNE图中（图7A）。一组DEGs（包括CFTR、PROM1、CD55和RHEX）在CSCs中明显上调，在CC II组中更为明显，意味着细胞的高度生长（图7B）。炎症反应有关的基因以及几种胶原蛋白，在间充质干细胞中的表达量比其他干细胞高。GSEA显示，CC I组的CSCs中富集的前6条路径与免疫反应有关（图7C），相反，与细胞生长相关的途径在CC II 的CSCs中被激活。TGFβ和细胞外基质组织的信号在CC II组的脂肪基质细胞（ADSCs）中显得更加丰富，而在CC I组的ADSCs中检测到了离子膜运输的激活（图7D）。

KEGG结果显示，多种癌症相关的信号是基底细胞和上皮细胞富集途径之一（图7E和7F）。许多表达角蛋白和胶原蛋白的基因被检测为四个非干细胞群的顶级差异基因，基因表达情况显示胶原蛋白普遍上调，除了淋巴内皮细胞外，角质蛋白也是如此（图7G）。角质细胞显示大多数角蛋白和胶原蛋白的高表达，胶原蛋白家族的几个成员在CC II组的多种细胞类型中被上调。这些异常表达与宫颈癌的风险呈正相关，这提示了它们在临床诊断中的潜在作用。

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图7 肿瘤相关干细胞和上皮细胞在CC I患者中具有更强的免疫应答活性

定量蛋白质组学显示CC II患者存在明显的免疫抑制现象

作者随后补充了定量蛋白质组学的分析，结果中有541个差异表达蛋白（图8A-B）。在CC II组中明显上调蛋白的相互作用结果显示，AKT1与其他几个与细胞外基质发展相关的高程度节点存在相互作用，如FN1、MMP9、PXN、CAT和CUL1（图8C）。GSEA显示IFN-α和IFN-β反应在CC I组富集，而通过NFκB的TNFα信号则在CC II组富集（图8D）。通过比较snRNA-seq分析检测到的IFN-α反应通路上的差异基因结果，作者发现它们在MΦs、Treg、NK、B细胞和DCs中表达较多，其中MΦs的表达水平最高（图8E）。在CC II组中，与免疫过程相关的前20个差异蛋白与它们的基因在不同免疫细胞群中的表达相关（图8F）。S100A8和S100A9的表达在CC II组的大多数细胞类型中被上调，而CD55和PXN在γδT细胞中被明显上调。

因此，与CC I组相比，CC II中形成了一个更具免疫抑制性的TME。

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图8 CC I和CC II的定量蛋白质组学分析

小结

在这项研究中，作者通过snRNA-seq和Label Free定量蛋白质组学分析，比较研究了I期和II期CC患者的TME。结果显示，II期CC患者几乎所有的免疫细胞异质性都受到了很大的影响，其表型具有明显的免疫抑制性，胶原蛋白可能被用作预后的标志物。这些发现为CC的临床诊断和免疫治疗提供了重要线索，值得进一步研究。

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