行业动态

人源粪便样本

小鼠模型

宏基因组

靶向代谢组

1.RS干预4个月可缓解中国成人NAFLD

作者共招募了200名非酒精性脂肪肝患者，并按1:1的比例随机分配给他们服用为期4个月的高淀粉玉米2型RS或等能量供应的对照淀粉（CS）（图1A）。经过四个月的干预后，与CS组相比，RS组中肝内甘油三酯含量（IHTC）显著降低，体重和BMI也有所下降（图1B-C），腹部MRI评估的内脏脂肪面积（VFAs）和皮下脂肪面积（SFAs）的减少程度在RS中明显更高（图1D-E）。

此外，RS干预后，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和γ-谷氨酰转肽酶（GGT）明显降低，这表明肝损伤得到了改善（图1F-H）。血脂异常也在 RS 干预后得到缓解，表现为总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的改善，而 CS 干预后则没有这种变化。非酒精性脂肪肝生物标志物成纤维细胞生长因子 21（FGF21）在RS 组中有所降低（图1I），脂多糖（LPSs）和其他炎症标志物MCP-1，IL1β 和TNF-a也显著降低（图1J-M）。

总之，上述数据表明RS处理降低了NAFLD患者的 IHTC，改善了肝损伤和相关代谢紊乱，即使在调整体重减轻后也是如此。

为了确认RS如何影响人类健康，作者在干预前后对RS组和CS组参与者的血清和粪便样本进行了靶向代谢组学研究，分别测定了血清中的30 种氨基酸（AA）和26种胆汁酸（BA）以及粪便中的10 种短链脂肪酸（SCFA）和 18 种BA。结果表明，在整体代谢层面上，RS和CS对物质变化有不同的影响（图2A）。在单个代谢物水平上，粪便中BA、血清中的BA和AA共有13种代谢物发生了显著变化，粪便中的SCFA无显著变化。其中，RS组中三种支链氨基酸（BCAA）（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的血清水平都有所下降，有10种代谢物（包括缬氨酸、苯丙氨酸和α-氨基丁酸）在基线时没有差异，但在干预结束时，RS 组和 CS 组之间有明显差异。

与临床参数之间的相关性分析表明，几种代谢物与人类 IHTC 水平呈显著正相关（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和酪氨酸）或负相关（氨基丁酸），BCAAs和一些BAs，包括血清牛磺胆酸（TCA）和血清甘氨胆酸（GCA）与三种非酒精性脂肪肝相关肝酶 ALT、AST 和 GGT 显著相关，丙氨酸、a-氨基丁酸和缬氨酸的血清水平也与血清总胆固醇相关（图 2C）

上述结果表明，RS干预可能会通过改变微生物代谢产物的水平，特别是人类宿主可用的AA库和BCAA水平，对NAFLD患者产生有益的影响。

图2 RS和CS干预4个月后粪便和血清代谢组学的变化

3.RS干预后肠道菌群的变化与NAFLD的缓解有关

为了研究微生物群的变化，作者对干预前后的参与者进行了粪便宏基因组检测，结果表明，干预前后的RS组和CS组之间出现了多样性上的显著差异，RS组的α多样性低于CS 组（图3A-B）。数据分析结果确定了包括Bacteroides stercoris在内的物种，与CS干预相比，RS干预后Bacteroides stercoris的丰度明显降低（图3C）。随后作者将所有重要细菌物种的丰度与一组临床参数相关联，并调整了与肥胖相关的测量值，以确定与非酒精性脂肪肝相关的关键物种（图3C），发现 B. stercoris 与 IHTC、ALT 和 AST 呈正相关。菌群与代谢物的关联结果中，Parabacteroides merdae在RS组中的丰度明显低于CS组，它与多种代谢物的显著相关性（大多为正）最高（图3D）。被RS清除的肠道微生物B. stercoris与血清缬氨酸水平呈正相关，与IHTC、ALT、AST、GGT和TG也呈显著正相关（图 2C）

图3 RS干预后肠道微生物群的组成变化与临床表型的改善有关

4.RS影响的肠道菌群在移植后可减轻小鼠NAFLD

为了进一步确认RS诱导的肠道微生物变化与肝脏脂肪变性减轻之间的潜在因果关系，作者收集了受试者粪便样本在小鼠模型上进行了粪菌移植实验（图4A）。与CS组相比，RS组降低了小鼠的体重和肝脏重量，血清中的FGF21水平明显降低，脂肪组织中FGF21受体、共受体和脂肪连蛋白的表达增加，糖代谢也得到了改善，尤其是胰岛素敏感性显著提高。组织学评估表明，RS组的粪菌移植后，FMT后肝脂肪变性、水肿、炎症和NAFLD活性评分显著降低（图4B-C），此外，RS组肝脏中的肝酶ALT和AST、肝TG和TC水平较低（图4D-G）。在分子水平上，肝脏中与炎症、巨噬细胞和中性粒细胞募集相关的标记基因的表达，以及脂肪生成基因的表达有所降低，同时促进了脂肪分解相关基因表达（图4H-K）。编码紧密连接蛋白的基因表达增加，表明肠道屏障完整性得到改善，血清LPS的显著降低，表明全身性炎症可能有所缓解（图4K-L）。与CS组相比，RS组的小鼠结肠内容物中的BCAAs 水平也显著降低（图4M）。

上述结果表明，RS能够通过影响肠道菌群构成来缓解NAFLD相关症状。

图4 RS相关肠道菌群移植后可减轻饮食诱导的小鼠NAFLD

5.多组学整合分析确定了与NAFLD缓解相关的关键物种

通过功能分析，作者发现14个碳水化合物活性酶（CAZy）家族在RS和CS干预后都发生了显著变化（图 5A），而只有在 RS 干预后，KEGG功能模块 M00060和M00320（LPS 生物合成，KDO2-脂质，LPS输出系统）的丰度才显著下降（图5B）。

为了揭示肠道微生物群变化与非酒精性脂肪肝缓解之间的潜在机理联系，作者采用了最近开发的计算框架来整合各种类型的数据，在RS组与IHTC明显相关的功能模块中，有四个与BCAA生物合成相关的KEGG模块（图5C和5D），这强调了BCAA在非酒精性脂肪肝发病机制中的重要作用。总体而言，在RS组中观察到的潜在KEGG模块（与FGF21或IHTC相关）和驱动物种比在CS组中观察到的要多得多，这进一步证明了RS以一种定向的方式改变了肠道微生物组的组成和活性。特别是有三个高度相关的驱动物种参与了四个BCAAs模块和IHTC之间的相关性（图5D）。B. stercoris 的丰度与IHTC、ALT、AST和血清缬氨酸相关，它对四个模块（包括缬氨酸/异亮氨酸生物合成的M00019）的平均驱动效应最强。

为了验证B. stercoris与NAFLD之间的正相关，作者重新分析了来自两个已发表的涉及NAFLD的队列的宏基因组数据，在一项中国队列研究中，NAFLD患者中B. stercoris的丰度明显高于非NAFLD参与者(图5E)。在一项欧洲队列研究中，肝脏活检诊断为中度或重度脂肪变性的患者与轻度脂肪变性或对照组相比，B. stercoris水平也较高(图5F)。

图5 RS干预后肠道微生物群功能的变化与表型之间存在相关性

6.B. stercoris部分通过LPS和BCAA的产生促进NAFLD的进展

为了研究B. stercoris对NAFLD进展的潜在因果效应，作者给小鼠喂食高密度脂蛋白胆固醇（HFHC）8周以诱发非酒精性脂肪肝，同时每天口服5×10^9 CFU/天的活菌或热处理的B. stercoris（图6A）。RT-PCR结果显示，活菌组的B. stercoris显著高于HFHC组（图6B）。活菌组小鼠血清中ALT水平升高了1.8倍，而AST则没有显著变化（图6-D），通过组织学评估，与HFHC小鼠相比，活菌组的小鼠肝脏脂质积累、炎症细胞浸润和纤维化都明显增加（图6E-J），肝脏TG水平高出2倍多（图6K），LPS 水平也显著升高（图6L），

为了确定B. stercoris在分子水平上的具体影响，作者研究了肝组织中炎症和纤维化标志物的转录情况。与组织学评分相一致的是，参与促炎症反应、炎症细胞浸润和胶原蛋白形成的基因在活菌组小鼠中明显增加（图6M-N）。此外，除了活菌外，热处理后的菌也一定的效果，能对炎症产生类似的影响（图6C-M），但热处理菌组的小鼠肝脏TG含量有低于活菌组的趋势（图6K）。总之，这些研究结果表明，B. stercoris丰度的增加导致了非酒精性脂肪肝的恶化。

由于B. stercoris对肠道微生物BCAA生物合成和IHTC之间的相关性有很强的驱动作用（图5C-D），作者随后测量了小鼠粪便中 BCAA 的水平。结果表明，活菌组的缬氨酸和异亮氨酸含量显著增加（图6O），热处理组无显著变化。随后作者通过多种细胞的实验，探究B. stercoris是否能直接产生BCAA，靶向代谢结果表明，B. stercoris活菌培养上清显示出显著的支链氨基酸积累，并呈时间依赖性，尤其是缬氨酸的积累（图6P）。

图6 B. stercoris可通过产生BCAA加重小鼠NAFLD症状

在这篇研究中，作者提供证据表明RS是一种新型、相对简单且廉价的NAFLD微生物群靶向治疗方法，它能将IHTC降低5.89%，并降低代表肝损伤的肝酶和全身炎症指标。肠道微生物群组成和功能的变化是RS对NAFLD改善的重要媒介，其中包括一种肠道微生物B. stercoris，能通过产生LPS和BCAA 来加重疾病进展。该研究有助于进一步了解NAFLD的发病机制，并开发基于微生物组的创新疗法或中药。