胃肠道含有人体最大的免疫器官，还有大量的微生物。微生物在宿主体内平衡中发挥着关键作用，如产生代谢物、抵抗病毒和病原体感染以及促进免疫系统成熟。由于肠道微生物群调节的代谢物，提供不易消化的化合物可以对宿主带来有益的生理作用；其中一些化合物被称为益生元。益生元益处的一个关键机制是肠道微生物群从不易消化的碳水化合物中产生短链脂肪酸 （SCFA），它可以降低肠道 pH 值以排除病原体并具有抗菌活性。益生元食品在健康方面具有重要作用，尤其是通过调节肠道微生物群以改善新陈代谢来治疗超重或肥胖。
火参果（Cucumis metuliferus）又名非洲黄瓜、刺角瓜、果冻瓜，属于葫芦科。它自然分布于非洲的热带和亚热带撒哈拉以南地区，在肯尼亚、新西兰、法国、以色列、澳大利亚、中国等地也有商业生产。据报道，火参果果实具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗溃疡和降血糖活性。果皮的重量约占整个猕猴桃的四分之一，是榨汁后的副产品。猕猴桃皮的成分是碳水化合物（54.84%）、水分（18.40%）、纤维（11.34%）、脂肪（8.89%）、灰分（3.59%）、蛋白质（2.95%）。含有生物碱、黄酮类、皂苷、单宁、甙、萜类和酚类。从成分分析的结果来看，多糖在猕猴桃中所占的比例最大。一般来说，果皮的细胞壁富含果胶，果胶由半乳糖醛酸（Gal A）、半乳糖醛酸（Gal A）、葡萄糖（Glu）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸（Gal）和鼠李糖（Rha）组成等。果胶的组成和结构与功能有关，包括抗氧化能力、免疫活性和体外抗癌活性。此外，来自不同来源的果胶对肠道微生物群有不同的影响。果胶的各种特性显示出很高的生物活性；然而，来自 C. metuliferus 果皮的果胶（CMPP）通常被丢弃和忽视。因此，这值得进一步研究。
2022年5月31日，华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室在Foods（IF=5.354）杂志上在线发表了“Immunological Activity and Gut Microbiota Modulation of Pectin from Kiwano （Cucumis metuliferus） Peels”的研究论文。通过单糖分析和紫外和可见光谱阐明了 CMPP 的组成。在此基础上，利用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）的细胞活力和免疫因子（NO、TNF-α、IL-6）评价CMPP的免疫活性。用人体肠道的动态模拟器（BFBL）模拟人体内环境，例如：pH、温度、厌氧和停留时间。该模型用于评估人类肠道微生物群落结构以及铵和短链脂肪酸产生的变化。
实验路线
图 1. 实验流程图
通过化学方法破译CMPP主要成分。CMPP中未检测到黄酮和多酚。此外，在紫外光谱中未观察到 260 nm 和 280 nm 处的吸收峰，表明在 CMPP 中也未检测到核酸和蛋白质。使用 HPAEC-PAD 检测单糖组成。如图2所示，CMPP主要由10种单糖组成，包括半乳糖醛酸（Gal A）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸（Gal）、葡萄糖（Glu）、木糖（Xyl）、Fuc（岩藻糖）、葡萄糖酸（Glu A）、甘露糖酸（Man A）和甘露糖（Man）。因此，单糖组成结果表明CMPP为果胶多糖。
图 2. CMPP 的单糖组成
2.细胞实验
2.1 细胞活力
使用 MTT 晶体形成来评估 CMPP 在 RAW264.7巨噬细胞上的细胞活力。与空白对照相比，CMPP 在 0.78–50 µg/mL 浓度下 24 h 的细胞活力高于100%（图 3），显着提高到 134% ± 9% 和 144% ± 12%（p < 0.01）。结果表明 CMPP 无细胞毒性，在 0.78-50 µg/mL 的 RAW264.7 上可促进细胞增殖。因此，该浓度范围可考虑用于后续研究。
图 3. CMPP 对 RAW264.7 巨噬细胞细胞活力的影响。细胞活力值超过 100% 意味着促进细胞生长。数据表示为平均值±标准差。** 高度显着与对照组不同，p < 0.01。
2.2 免疫活性
巨噬细胞的免疫反应与人类健康高度相关，细胞因子（NO、IL-6、TNF-a）分泌的增加常被用来评估免疫活性。如图4 A所示，CMPP在0.78-50 ug/mL浓度范围内显著（p < 0.01）增加NO生成，且呈剂量依赖性；TNF-a的释放（图4B）也随CMPP浓度的增加而显著增加（p < 0.01），且呈剂量依赖性；当CMPP浓度为50 ug/mL时，RAW264.7细胞的IL-6分泌明显增加（图4C） （p < 0.01）。在CMPP最高浓度（50 μg/mL）时，NO、TNF-a和IL-6的产生均低于LPS组，提示CMPP的免疫调节作用强于LPS。综合来看，CMPP具有免疫活性。
图4. CMPP激活的RAW264.7细胞产生NO （A）、TNF-a （B）和IL-6 （C）。LPS组为过量生产的阳性组，0.78 ~ 50 ug/mL的CMPP较LPS组更为温和。数据以平均值±标准差表示。**与对照组（0 ug/mL）差异极显著，p < 0.01。
3.微生物代谢物分析
3.1 短链脂肪酸含量
肠道菌群消化碳水化合物代谢的主要代谢产物是短链脂肪酸。升结肠（AC）、横结肠（TC）和降结肠（DC）三个隔室在稳定期、进样期和冲洗期的短链脂肪酸（SCFAs）浓度结果如图5所示。稳定期的短链脂肪酸含量以乙酸居首，丁酸和丙酸次之。与稳定期相比，在摄食期AC、TC和DC的乙酸含量平均分别增加了1.07、1.05和1.10倍。AC、TC和DC的丙酸含量分别提高了1.26、1.21和1.24倍;丁酸含量分别提高了1.07、1.10和1.22倍。乙酸、丁酸和丙酸在采食期均有增加，尤其是DC组（p < 0.05）。随后，在冲洗期SCFAs浓度下降，其数据与稳定期相似。短链脂肪酸是果胶多糖发酵的重要产物。半乳糖和半乳糖醛酸经发酵得到乙酸和丁酸。醋酸作为肌肉的主要能量来源参与脂质代谢。丁酸与保护上皮细胞有关，具有抗炎作用，而丙酸主要是阿拉伯糖和葡萄糖发酵的产物，与能量途径的调节和饱腹肽/激素的释放有关。结合单糖组成结果，CMPP富含Gal A、Ara、Gal和Rha，可发酵增加短链脂肪酸。3个隔室丙酸均显著（p < 0.05）增加，表明CMPP可使丙酸菌产生利用。
图5. 稳定期（s-p）、摄食期（i-p）和冲洗期（w-p）在升结肠（AC）、横结肠（TC）和降结肠（DC）中短链脂肪酸（SCFAs）含量。数据以平均值±标准差表示。*与稳定期比较差异显著，p < 0.05。
3.2 铵含量
测定铵的含量是为了评价蛋白质的发酵，蛋白质水解发酵的代谢产物或最终产物有潜在的毒性。结果表明，铵态氮含量在稳定期的AC、TC和DC分别达到12.58 ± 2.34 mM、15.65 ± 2.34 mM和14.32 ± 0.74 mM的平均值（±SD）；经CMPP干预后，三种反应器中铵的含量分别下降（AC为10.17 ± 0.50 mM, TC为13.21 ± 1.54 mM, DC为13.62 ± 0.45 mM）；与采食期相比，洗脱期铵态氮含量有所增加，AC为10.28 ± 1.35 mM, TC为14.24 ± 1.50 mM, DC为13.98 ± 0.97 结果表明，在CMPP摄入期间，蛋白质水解代谢下降。当人类和动物模型补充不可消化的碳水化合物时，大肠内蛋白质发酵的减少，降低粪便水的遗传毒性是一致的。
3.3 肠道菌群分析
通过BFBL肠道模型中肠道菌群的变化，分析了CMPP潜在的益生前效应。在此基础上，通过qPCR检测三个试验期最后3天在AC、TC和DC的平均细菌计数（表1）。与稳定期相比，在CMPP摄入期间Bacteroides、Feacalibacterium和Roseburia的菌群数量增加。虽然AC中Akkermansia的数据低于检测水平，但TC中有增加的趋势。Akkermansia可以利用CMPP中的半乳糖和葡萄糖作为碳源生产丙酸。据报道，Akkermansia与炎症性疾病的改善和对代谢性疾病的保护有关，包括预防2型糖尿病（T2D）和减少心血管疾病；Bacteroides在试验期间增加，主要是在AC （p < 0.05），这与丙酸和乙酸的产生有关。中国T2D患者中Akkermansia、Bacteroides、Feacalibacterium和Roseburia减少；另一方面，Bifidobacterium在试验期间有轻微的增加趋势，但不显著。该属可降解多种碳源，包括单糖和双糖，以及木糖、半乳糖和低聚果糖等复杂碳水化合物。Bifidobacterium通过发酵碳水化合物产生乙酸和乳酸，并通过交叉饲喂机制刺激丁酸的产生。Bifidobacterium还可改善糖尿病相关并发症及肥胖；CMPP也有增加TC和DC中Feacalibacterium的趋势（p < 0.05）。与慢性胰腺炎患者和肥胖组相比，对照组的Feacalibacterium较高，与炎症改善也呈正相关；CMPP处理后Roseburia明显增加，以AC组的最为明显（p < 0.05）。它可以发酵几种碳水化合物，包括木糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉和糖原。研究表明，健康人的Roseburia丰度高于T2D患者。Feacalibacterium和Roseburia被认为是丁酸[49]的主要生产者，他们的减少被标记为预测欧洲妇女的糖尿病。总的来说，摄入期间增加的细菌群主要与T2D、肥胖和减轻炎症有关，提示CMPP可以改善这些症状。
表1. CMPP胃肠道消化过程中用于细菌组分析的qPCR计数平均值（log copy number/mL）。*与稳定期比较差异显著，p <0.05。
为了更好地了解CMPP对健康的影响，还需要进一步研究以下问题：（1）确定有利于健康的CMPP适宜浓度范围和干预时间。将 CMPP 鉴定为益生元并确定合适的剂量是具有挑战性的，但也是有益的。（2）了解CMPP对体内肠道菌群及相关疾病的复杂影响，根据肠道菌群的功能特性，建立相关数据库，进行个性化营养管理。（3）解读加工方式对CMPP的影响，发展食品行业果蔬副产品的回收利用。这些研究将对果胶、肠道菌群和宿主健康之间的关系至关重要。
通讯作者介绍：
Teresa Requena，女，博士，西班牙马德里食品科学研究所-生物技术与微生物学系首席研究员。主要研究方向为肠道微生物。
王弘，女，博士，华南农业大学食品学院教授，博士生导师，广东省珠江学者特聘教授，广东省生物工程学会生物传感器专业委员会副主任委员，广东省高等学校“千百十”工程省级培养对象。主要研究方向为食品安全与营养。
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