背 景
非生物胁迫会影响作物蛋白质、脂质、非结构性碳水化合物、矿物质、抗氧化剂、饲料价值以及物理和感官特性。然而，非生物胁迫对营养和功能特性的影响因作物而异；例如，干旱胁迫会增加葡萄中的酚类浓度，但会降低马铃薯中的酚类浓度。盐胁迫提高了西兰花中的酚类浓度，但降低了生菜中的酚类浓度。我国盐碱地面积超过5亿亩，给我国粮食安全带来重大隐患。然而，目前还没有关于作物籽粒响应碱胁迫的研究。糜子是一种古老的谷类作物，广泛种植在伴随盐碱胁迫的干旱半干旱地区，且糜子籽粒具有宝贵的食用价值，但目前关于碱胁迫对糜子籽粒代谢物丰度的综合定性和定量信息仍是空白。
2023年6月，Food Research International（IF= 8.1）杂志上发表的一篇题为“Widely targeted metabolomic analysis revealed the effects of alkaline stress on nonvolatile and volatile metabolites in broomcorn millet grains”的研究论文，从糜子籽粒功能性物质和营养成分的角度描述了碱胁迫对糜子籽粒品质的影响，为碱化地区的糜子食品化学和功能性食品开发研究提供有价值的信息。在这项研究中，三黍生物提供了相应酚酸、类黄酮等代谢物及矿质元素检测服务。
【样本类型】
糜子籽粒
【技术方法】
靶向代谢检测
LC-MS非靶代谢
GC-MS非靶代谢
【技术路线】
【研究结果】
·糜子籽粒对碱胁迫的生长和理化响应
在本研究中，作者比较了碱敏感糜子S223和耐碱糜子T289在正常和碱胁迫条件下的籽粒生长特性和理化性质。结果表明，碱胁迫显著减少了两个糜子品种的单株穗粒数、单株鲜/干粒重和千粒重。此外，碱胁迫显著减少了糜子籽粒的长度，但对籽粒宽度没有显著影响（图 1），籽粒中的总酚、总类黄酮、花青素、类胡萝卜素和单宁含量，以及维生素E（VE）和维生素B（VB）含量均有所改变。S223中的δ-VE和VB2含量也大幅增加。与对照（CK）相比，籽粒中N、Mg、Mo、Na、Al、Sr、Ba的含量在碱胁迫（AS）组显著增高，而Cu、Cr的含量显著降低。Na增加幅度最大，碱胁迫下S223和T289的Na含量分别是正常条件下的17.05和6.20倍。碱胁迫对两个品种K、Ca、Fe、Ti、Mn、Zn和Ni浓度的影响不一致。碱胁迫对籽粒P、B、Pb、Co和Li含量没有显著影响（图 2）。
图 1 碱胁迫对糜子籽粒发育的影响
图2 碱胁迫对糜子籽粒活性成分及矿质营养的影响
·糜子籽粒对碱胁迫的非挥发性代谢组响应
随后，我们对糜子样品中的代谢物进行了代谢组学分析。两个糜子品种在正常和碱胁迫条件下的籽粒代谢存在明显差异（图3A-E）。在S223CK与S223AS中鉴定出114个差异代谢物（DAM），在T289CK与T289AS中鉴定出89个DAM，其中包括28个共有DAM（图3F）。
聚类分析结果显示DAM可被分为6个亚类（图4A），其中，S223组中，生物碱、酚酸、氨基酸及其衍生物、其他代谢物、核苷酸及其衍生物、黄酮类、有机酸、木质素、香豆素、萜类和脂类分别占21.9％、20.18％、14.04％、9.65％、7.02％、6.14％、6.14％、5.26％、5.26％和4.39％，T289中的物质分类也如图所示（图4 B）。
如图5A所示，碱胁迫后，S223和T289的挥发性代谢物均有较大差异，分别鉴定到43个下调DAM和71个上调DAM以及10个下调和79个上调DAM（图5B-C）。其中，S223中最显著上调的代谢物是血清素，最显著下调的是左旋肉碱，T289中，十六戊二酸是最显著上调的代谢物，而2-羟基异戊酸是最显著下调的代谢物（图3D）。
图 3 比较组间非挥发性代谢物分析
图4 差异代谢物K-Means聚类分析和不同类型差异代谢物百分比
图5差异非挥发性代谢物分析
·糜子籽粒不同种类非挥发性代谢物对碱胁迫的响应
在本研究中，鉴定到的非挥发性差异积累代谢物涉及生物碱、酚酸、类黄酮、氨基酸及其衍生物、有机酸等多类代谢物（图6）。
其中，生物碱类代谢物的显著差异可能归因于碱胁迫处理对不同耐碱性糜子品种的影响；碱胁迫对两个糜子品种籽粒中氨基酸及其衍生物的影响并不完全一致，S223籽粒中大部分氨基酸及其衍生物在碱胁迫下显著增加；28个类黄酮差异代谢物表明，糜子籽粒可能通过类黄酮的积累抵抗碱胁迫；而两品种籽粒本身的酚酸类代谢物含量存在明显差异，这可能导致两个品种在碱胁迫下籽粒中酚酸反应的不同变化；此外，还检测到15个差异积累的有机酸代谢物，碱胁迫上调了S223籽粒中γ-氨基丁酸、粘康酸、4-苯基丁酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、2-异丙基苹果酸和3-羟基戊二酸的积累，同时下调了D-赤藓酮的积累，在T289中，籽粒中柠檬酸、异柠檬酸、L-苹果酸、DL-3-苯乳酸*、1-甲基哌啶-2-羧酸、3-甲基苹果酸、2-丙基琥珀酸、草酸和3-羟基戊二酸积累，γ-氨基丁酸和2-羟基异己酸下调。
图6 正常条件和碱胁迫下糜子籽粒中非挥发性代谢物的热图
·糜子籽粒对碱胁迫的挥发性代谢组响应
我们随后检测了糜子籽粒中挥发性代谢物的变化，在S223中鉴定出16个DAM， T289中检测到20个DAM，其中存在3个共同的DAM（图7 A-B）。碱胁迫后引起了两品种糜子籽粒的挥发性代谢物积累发生变化（图7 C-D）。
随后，利用代谢物含量动态分布图和雷达图分析了S223和T289籽粒中Top10的差异代谢物（图8A-B），结果表明，S223籽粒中下调最显著的代谢物是双环[3.1.1]庚-3-烯-2-酮，4,6,6-三甲基-，（1S）-。T289籽粒中上调最显著的代谢物是苯乙烯。代谢物热图分析表明碱胁迫降低了S223籽粒中的大部分挥发性代谢物的相对含量，而增加了T289籽粒中大部分挥发性代谢物的相对含量（图8 C）。
图7 差异挥发性代谢物比较分析
图8 差异挥发性代谢物的分析
·糜子籽粒品质特性相关途径对碱胁迫的响应
上述综合结果表明，在类黄酮生物合成途径中，碱胁迫降低了S223和T289籽粒中野樱素的积累。木犀草素在S223籽粒积累降低，但T289籽粒木犀草素的积累增加。同时，碱胁迫促进了芹菜素-7-O-新橙皮苷在黄酮和黄酮醇生物合成途径中的积累。碱胁迫下，抗坏血酸和醛糖酸代谢途径的所有代谢物积累增加。在本研究发现碱胁迫影响了糜子籽粒氨基酸和有机酸生物合成途径。碱胁迫下，糜子籽粒中脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成和色氨酸代谢途径被激活。同时，糜子籽粒通过调控氨基酸的生物合成和TCA循环响应碱胁迫。在碱胁迫下，糜子籽粒中L-苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、L-瓜氨酸和L-甲硫氨酸积累增加。这些结果表明，糜子籽粒通过促进某些酚酸、类黄酮和抗坏血酸的合成，增加糜子籽粒抗氧化物质抵抗碱胁迫（图 9）。同时，碱胁迫下，糜子籽粒中氨基酸和有机酸的积累增加，这可能影响糜子籽粒的风味品质。
图 9 碱胁迫对糜子籽粒代谢相关途径的影响
【小结】
在这项研究中，我们探究了碱胁迫下糜子籽粒功能性物质、营养物质的变化，揭示了通过调节苯丙素生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、抗坏血酸代谢、氨基酸和有机酸代谢途径响应碱胁迫。本研究首次阐明了糜子籽粒非挥发性和挥发性代谢物对碱胁迫的响应，为碱化地区糜子种植和糜子衍生食品的开发提供了有价值的信息。
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文字：牛晶晶
排版：野凌
审核：三黍生物市场部
