研究背景葫芦素是一种苦味极高的化合物，主要存在于丝瓜属的葫芦科植物中。然而，目前还没有对丝瓜果实中葫芦素生物合成的综合分析。因此，该文章对丝瓜苦味(WM709)和非苦味(S1174)基因型进行分析，通过整合代谢组和转录组分析来揭示葫芦素生物合成的潜在机制。该文章共检测到422种代谢物，包括维生素、必需氨基酸、抗氧化剂和抗肿瘤物质。其中131种代谢产物在苦丝瓜果实(WM709)和非苦丝瓜果实(S1174)之间存在显著差异。苦丝瓜中异葫芦素B、葫芦素D、23、24-二氢葫芦素E、葫芦素F的含量显著高于非苦丝瓜。转录组分析显示，Bi、细胞色素p450s (CYP450s)和葫芦素合成途径的酰基转移酶(ACT)显著上调。此外，干旱胁迫和脱落酸(ABA)激活了葫芦素生物合成途径的基因。此外，双荧光素酶报告基因和酵母单杂交实验表明，aba反应元件结合因子1 (AREB1)结合到Bi启动子上，激活Bi表达。对丝瓜和黄瓜基因组的比较分析表明，Bi、CYP450s和ACT位于保守的共顺位点，并形成葫芦素生物合成簇。本研究为深入了解葫芦素生物合成途径的主要基因和代谢产物提供了重要线索，加深了对葫芦素生物合成调控机制的认识。
研究材料
丝瓜非苦果S1174和苦果WM709进行了研究。
技术方法：转录组学，荧光定量PCR，酵母单杂实验。
研究结果
1. 两个丝瓜品种果实代谢产物的鉴定
通过代谢组分析，探讨丝瓜S1174和WM709两个品种间的代谢物差异。共检测出2个品种的422种代谢产物，通过heatmap分析，可以清楚地区分出两个品种的代谢物(图1C)。因此，根据OPLS-DA将6个样本进一步分为两组(图2)。
图1 代谢物分析结果
图2 OPLS-DA结果
2. 代谢物功能分析
通过对差异代谢物进行分析发现，这两个品种间有131个代谢物存在显著差异，其中61个上调，70个下调。对差异代谢物的KEGG通路分析显示，富集程度最高的5种途径分别为甘油磷脂、α -亚麻酸、嘌呤、嘧啶和亚油酸代谢。此外，泛素和萜类醌生物合成代谢物途径显著富集。在苦丝瓜S1174中，高水平的代谢产物富集了嘌呤代谢、嘧啶代谢和ABC转运蛋白(图3)。此外还发现苦丝瓜中萜类化合物的含量显著高于非苦丝瓜(图4B)。
图3 代谢物富集分析结果
图4 代谢物富集分析结果
3. 两个丝瓜品种果实中差异表达基因的研究
通过对差异表达基因的研究，最终在两个品种间鉴定出2634个差异表达基因，其中上调基因1455个，下调基因1179。转录组分析发现，在WM709和S1174之间有222个差异表达基因(98个上调，124个下调)，并且给出了其分别属于的代谢途径。
图5 差异表达基因分析结果
4. 葫芦素生物合成途径基因的表达
考虑到黄瓜中葫芦素的生物合成及其调控途径，作者以黄瓜基因的氨基酸序列为查询对象，对丝瓜中的Bt、Bi、ACT、CYP450s和UGTs同源基因进行了BLASTP搜索。结果表明，LaBi基因与黄瓜Bi同源，其编码一个氧化角鲨烯环化酶(OSC)，该基因在WM709中表达量高于在S1174中(图6A)。此外，5个CYP450s基因和ACT基因显著上调(图6B)。
图6 基因表达分析结果
5. 干旱胁迫和ABA处理激活葫芦素生物合成基因
通过对丝瓜幼苗进行干旱胁迫和ABA处理，验证胁迫是否激活葫芦素基因。结果表明，干旱胁迫和ABA处理显著增加了Bi、ACT和CYP450s的表达(图7A,B)。作者随后进行了双荧光素酶报告基因检测和酵母单杂交实验。结果表明，AREB1通过直接结合LaBi启动子正向调控LaBi的表达。
图7 荧光定量PCR以及酵母单杂
小结
综合代谢组和转录组分析表明丝瓜是一种重要的药用植物，具有很高的营养价值。在本研究中，苦丝瓜中有11种萜类化合物，包括葫芦素D、葫芦素F和23,24-二氢葫芦素E上调。葫芦素生物合成基因Bi、CYP450s和ACT均显著上调，形成基因簇，维持葫芦素的有效生物合成。在受到胁迫的丝瓜中，AREB1与Bi启动子结合，激活Bi的表达。这些发现揭示了葫芦素生物合成和非生物胁迫反应之间的直接联系，并加深了对葫芦素生物合成调控机制的理解。
三黍项目
