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2022.11.29

文献解读

文献解读|普拉梭菌可通过丁酸盐-肾脏GPR43轴减轻慢性肾脏疾病

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背景

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慢性肾脏疾病（CKD）是影响世界人口约10%至15%的最重要公共卫生问题之一的重大疾病。CKD通常与高血压、肾功能障碍、肾纤维化和最终的慢性肾功能衰竭有关。尽管有现有的临床管理策略，但CKD在世界范围内的发病率和死亡率都很高，需要新的解决方案。宿主-微生物相互作用与普拉梭菌缺失已有报道。然而，关于普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）是否和如何可以作为一种益生菌并治疗CKD的机制仍不清楚。

西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系李宏宝副教授/康玉明教授团队长期致力于宿主肠道微生物在高血压、慢性肾脏病中的作用及机制研究。2022年9月27日，该团队在Circulation Research（IF=23.213）杂志上在线发表了题为“Faecalibacterium prausnitzii Attenuates CKD via Butyrate-Renal GPR43 Axis”的研究论文。该论文通过使用小鼠CKD模型，发现了普拉梭菌在CKD患者肾功能恢复中具有新的有益作用，研究了益生菌诱导的有益结果的分子机制，为利用普拉梭菌治疗CKD的潜力提供了必要的基础。

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技术路线

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研究结果

1.1
美国及中国CKD人群中普拉梭菌的枯竭及微生物的失调

为剔除个体差异的影响，作者通过DESeq2分析了来自美国以及中国受试者的肠道微生物组成。结果发现普拉梭菌在非CKD中富集，拟杆菌属在CKD中富集。且与健康对照组相比，实验组的α-多样性参数较低(图1)。

为了研究肠道菌群的改变是否与CKD的任何临床特征相关，作者通过Spearman相关性分析发现普拉梭菌属与尿酸、BUN、Scr和LDL呈负相关，与肾小球滤过率、总胆固醇和HDL呈正相关，这些表明粪杆菌属在肾功能中的重要作用。作者还研究了几种微生物源性代谢物的血清水平。CKD和CKD-HTN（慢性肾脏及高血压患者）中丁酸盐（普拉梭菌产生的主要代谢物）、醋酸盐、丙酸盐均减少，CKD-HTN中TMAO显著高于CKD和对照组（图2）。

图1.美国肠道工程和中国慢性肾脏病(CKD)人群数据库中普拉梭菌的缺失

图2. 三组与临床特征的相关性分析

1.2
普拉梭菌改善CKD小鼠的肾功能障碍和纤维化

作者为了证明普拉梭菌对CKD小鼠相关病理现象具有改善作用，通过5/6 Nx手术诱导小鼠CKD，持续4周，然后用普拉梭菌灌胃治疗。与假手术组相比，CKD组BUN和Scr水平升高，经普拉梭菌治疗后，CKD小鼠中BUN和Scr的增加被减弱。染色结果也表明，与CKD组相比普拉梭菌治疗减轻了CKD的病理进展，表现为肾间质中的肾纤维化减少，肾损伤和肾小管损伤减少。另外，普拉梭菌治疗显著降低了α-SMA和FN的基因的表达。（图3）

图3. 普拉梭菌(FP)可改善慢性肾脏疾病(CKD)小鼠的肾功能障碍和纤维化
1.3
CKD小鼠肾巨噬细胞浸润和炎症减弱

作者接下来检查了肾脏的炎症状态。通过f4 /80阳性染色证实了CKD小鼠肾巨噬细胞浸润增加，但经普拉梭菌治疗后有所降低。与此同时，5/6 nx诱导的CKD小鼠肾皮质中上调的Mcpt1、Il1b和Il6 mRNA水平在普拉梭菌治疗后部分降低。（图4）
图4. 普拉梭菌(FP)减弱CKD小鼠肾巨噬细胞浸润和炎症
1.4
普拉梭菌减弱CKD小鼠循环尿毒症T毒素

为了证明普拉梭菌治疗是否改善了CKD小鼠的循环尿毒症毒素，作者测量了血浆中3种微生物源性毒素和3种非微生物尿毒症毒素的水平。与假手术组相比，CKD组血浆中所有6种毒素的水平均升高。而普拉梭菌治疗显著降低了血浆中PCS、TMAO和胍丁二酸的水平。（图5）

图5. 普拉梭菌(FP)减少了CKD小鼠的循环尿毒症毒素
1.5

普拉梭菌改善CKD小鼠的肠道微生物组成

作者为了验证普拉梭菌对肠道有益，通过16s测序测定了CKD小鼠的肠道微生物。与假对照组相比，CKD小鼠的Shannon多样性下降，普拉梭菌处理显著增加了表征、Chao 1丰富度和Shannon多样性。（图6）
图6.普拉梭菌改变了CKD小鼠体内的肠道菌群组成
1.6
普拉梭菌对CKD小鼠的肠道炎症、血浆以及粪便的影响

作者通过PCR、血浆I-FABP等检测了小鼠肠通透性,并验证了普拉梭菌治疗对肠道炎症和通透性具有积极作用。CKD小鼠血浆中fitc -葡聚糖和I-FABP水平升高，这两种细胞均通过普拉梭菌治疗而降低。
普拉梭菌是公认的丁酸盐生产者，作者分析了4组小鼠的SCFAs水平, 与假小鼠相比，CKD小鼠的粪便和血浆中观察到的丁酸盐较少而普拉梭菌则是增加了丁酸盐水平。这些结果以及菌群的变化表明丁酸盐产量的增加可能是普拉梭菌肾脏保护作用的重要机制。

1.7普拉梭菌增加CKD小鼠GPR43的表达
为了进一步分析普拉梭菌介导的肾脏保护是否通过丁酸盐来完成，作者评估了丁酸盐的受体GPR-43、GPR-109A和GPR-41的表达。CKD小鼠的普拉梭菌治疗挽救了CKD中较低的GPR-43的基因表达，这表明产生丁酸的普拉梭菌对肾脏的保护可能是通过过量的丁酸与其受体GPR-43结合。（图7）

图7.普拉梭菌降低了CKD小鼠的GPR43的表达

1.8
通过丁酸- GPR -43途径减少肾脏炎症及肾功能障碍

作者又通过建立脂多糖诱导肾小管上皮细胞TCM K-1和肾足细胞MPC-5炎症的体外模型来验证普拉梭菌是否有抗炎作用。
在这两种细胞系中，证实了由脂多糖诱导的Il1b和Il6的过表达受到了普拉梭菌和丁酸钠培养上清液的抑制。接着为了证明GPR43的作用，使用siRNA敲除GPR43，发现GPR43敲除阻断了普拉梭菌介导的TCMK-1和MPC-5细胞中Il1b和Il6 mRNA水平的下调。（图8）

图8. 普拉梭菌(FP)通过丁酸- GPR(G蛋白偶联受体)-43途径减轻肾脏炎症

为了确定普拉梭菌介导的肾脏保护是否通过GPR-43，作者使用携带靶向小鼠Gpr43编码序列的短发夹RNA的腺相关病毒敲除小鼠肾脏中的GPR-43。结果显示GPR-43敲除阻断了经普拉梭菌治疗的CKD小鼠所减少的BUN和Scr。GPR-43的下调抑制了普拉梭菌治疗后肾脏纤维化和肾小管损伤的缓解。肾脏中GPR-43的敲除阻断了普拉梭菌治疗减少的F4/80阳性染色，也抑制了普拉梭菌治疗后的肾脏中几种炎症基因的mRNA表达减少。（图9）

图9. 普拉梭菌通过GPR43改善CKD小鼠的肾功能异常和炎症

1.9
丁酸通过GPR-43改善CKD小鼠的肾功能障碍和炎症

作者用AAV抑制了GPR-43的表达，并给予丁酸钠治疗。GPR-43的敲除阻断了CKD小鼠中丁酸介导的BUN和Scr的改善。GPR-43敲低抑制丁酸处理对肾脏纤维化和肾小管损伤的缓解。此外GPR-43敲低阻断了丁酸盐处理肾脏中减少的F4/80阳性染色和Mcpt1、Il1b和Il6的mRNA水平。以上研究结果表明，普拉梭菌对肾脏炎症和功能障碍的保护作用是通过丁酸- GPR-43途径发挥作用的。（图10）

图10. 丁酸酯通过GPR -43改善CKD小鼠的肾功能障碍和炎症
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小结
该项研究证实了普拉梭菌的缺失是西方和东方CKD患者的一个共有特征，与种族无关。此外，研究还发现了普拉梭菌在CKD进展中未被认识的作用，并进一步论证了普拉梭菌衍生的丁酸盐与GPR43相互作用以及其对CDK有益的作用机制。综上所述，该项研究阐明了普拉梭菌在恢复肾功能方面的机制作用，并拓展了普拉梭菌作为CKD治疗益生菌的前景。