盐分胁迫是全球粮食安全的一个重大问题，揭示植物在盐度下存活的机制具有重要意义，目前盐胁迫下高粱中差异表达基因及其相对表达情况的系统分析尚未报道。2021年10月Antioxidants在线一篇“Genome-Wide Transcriptome Profiling, Characterization, and Functional Identification of NAC Transcription Factors in Sorghum under Salt Stress”研究论文。该研究通过代谢组学和转录组学研究确定高粱耐盐性背后可能的调控网络，有助于建立盐高粱敏感分子网络，并为耐盐种质保持和谷类作物改良提供见解和方向。
研究对具有不同耐盐性的两种高粱基因型（SSG 59-3和PC-5）进行表型评估，然后在不同盐浓度下种植。从高粱叶片中提取总RNA，进行转录组测序。对生成的原始数据进行差异表达分析、系统发育分析。
盐胁迫显著降低了一些表型参数，在抗性（SSG 59-3）和易感（PC-5）高粱基因型之间观察到显著差异（p<0.05）。与易感基因型相比，耐盐基因型SSG 59-3在盐浓度下保持了较强的根系和地上部生长，地上部和根系长度以及鲜重和干重的减少最小（图3）。
图3 在正常（对照）和盐胁迫条件下生物量积累和形态表现
在耐性和易感基因型中，Na浓度对根和地上部生物量的影响均显著（p<0.05），而在处理植株中， PC-5（4.92）在地上部积累的Na离子浓度显著高于SSG 59-3（1.62）（图5）. 此外， SSG 59-3在地上部保持较高的钾浓度，而PC-5的钾浓度显著降低。在120mM NaCl胁迫下，两个品种的钾离子浓度均下降。根据Na和K离子浓度，两种基因型的根和地上部的Na/K比率均受到显著影响，且PC-5的Na/K比率高于耐SSG 59-3。
图5 盐胁迫对高粱基因型离子谱的影响
盐胁迫会导致活性氧的含量增加，从而干扰细胞氧化还原稳态并导致氧化损伤。H2O2含量和细胞膜氧化损伤标记物（应激指数（RSI）和丙二醛（MDA））。NaCl浓度的增加导致H2O2含量的积累显著增加，尤其是在P<0.05时，氧化应激标记表明，盐诱导的氧化应激显著影响叶片组织。由于氧化损伤，SSG 59-3积累的应激标记物较少。
图8盐胁迫对氧化应激标记物物的影响
共检测到32412个差异基因（DEG），其中20650个上调，11762个下调。通过比较耐盐基因型和易感基因型的对照组织和盐处理组织之间的DEG数量，进一步的实验分析两个品种在对照和盐胁迫处理下调控的DEGs的表达谱。根据DEG的热图显示，所有DEG在对照组织和应激组织的样本中表现出差异表达，表明关键反应机制在耐盐基因型（SSG 59-3）和易感基因型（PC-5）之间存在差异。
图11差异基因聚类热图
图12 DEG的数量和分组
在耐盐SSG 59-3基因型中，与膜和离子转运蛋白类等相关高度表达（图13）。基于细胞成分的分类显示，大多数DEG存在于细胞内区域（41%），其次是细胞和解剖活动（45%）和含蛋白质复合物（14%），而在PC-5中，观察到四类DEG存在于细胞内区域（43%）其次是生物合成过程（23%）、细胞和解剖活动（21%）和含蛋白质复合物（11%）。
图13 GO分析
在选定的候选基因中，这些基因在盐度下起着至关重要的作用，并通过qPCR分析进行了验证。NCED3（XP_004508176.1）是一个应对非生物胁迫的关键ABA合成基因，在信号转导途径中发挥重要作用。TF的网络分析显示几种盐敏感蛋白的复杂相互作用，这些蛋白的表达在高盐胁迫下上调，如LEA、WRKY、bHLH92、锌指蛋白和E3泛素蛋白连接酶。其他重要基因在高盐度下被发现上调，包括富含脯氨酸的伸展蛋白、结构细胞壁成分、信号传导、钙结合蛋白CML18等。
图15 网络分析
7｜SbNAC1-TFs的系统发育树、结构和基序分析
比较了来自相关物种（即玉米、水稻、芒属、野生穗、狗尾草、大麦和洋地黄）的129个氨基酸序列，以评估它们之间的进化关系。从ML树的拓扑结构中识别出约129SBNAC1TF，这些识别出的TF被分为八组。基于SBNAC1蛋白质的85个氨基酸序列，使用MEGA X中的ML方法构建系统发育树。结果显示，大多数的SBNAC1 TF基因没有或每个基因有1-2个内含子，而BNAC1-67有9个内含子，BNAC1TF的DNA结合域揭示了参与盐度响应的主要氨基酸残基。
图14 高粱NAC1蛋白的MEGAX系统发育树（ML法）
高粱在高盐度下的差异表达基因被发现与几种代谢和生物过程有关。研究耐盐基因型（SSG 59-3）和易感基因型（PC-5）之间共同DEG的总体示意图，以解释这些差异表达基因在盐胁迫下高粱中的潜在作用。结果表明，这些DEG参与转运功能、细胞膜完整性、应激反应和信号转导，并与盐胁迫的基本功能相关。（图17）。
图17 不同盐浓度下获得耐盐性的分子机制示意图
研究进行qPCR表达分析，以确定所选候选基因的途径是否与高粱基因型的耐高盐性有关。在与RNA-seq相同的实验条件下制备了一组类似的样品，针对盐胁迫作用选择的DEG进行qPCR分析。结果表明，在RNA-seq分析和qPCR中，所有10个基因的表达趋势相似（上调或下调）。
图18 基于qPCR基因的表达水平（A–I），PP2A基因用作参考基因