甘薯（Ipomoea batatas）是世界上最富含淀粉的根系作物之一，也是人类营养和工业原料的来源。作为甘薯块根中最重要的组成部分：淀粉，主要由直链淀粉和支链淀粉组成。已有的文献已经证明，淀粉的生物合成需要五类核心酶，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADPG），淀粉合酶（SS），淀粉分支酶（SBE），淀粉脱支酶（DBE）和颗粒结合淀粉合酶I（GBSSI），它们位于叶绿体或淀粉状体中。GBSSI负责直链淀粉的生物合成；SBE包括淀粉分支酶I（SBEI）和淀粉分支酶II（SBEII），负责支链淀粉的生物合成。高支链淀粉具有很好的粘度和口感体验；高直链淀粉相对于支链淀粉具有更好的工业性能和工业利用价值。已有的研究证明通过RNA干扰（RNAi）技术抑制GBSS基因，能够显著提高支链淀粉含量，形成蜡质淀粉；干扰SBE基因则可以显著提高直链淀粉的含量，获得高直链淀粉，但是会造成甘薯块根发育受损，减产严重。目前所有已知甘薯品系直链淀粉含量介于15%-30%之间，工业利用价值不高。
图 甘薯野生栽培种泰中6号和徐薯22号表型
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑是分子育种的革命性技术，已经成功对小麦、稻米、番茄、马铃薯等多种农作物进行了品质改良。然而，由于甘薯基因组庞大（2n = 6x = 90）、遗传背景复杂（六倍体）、自交不亲和、遗传转化困难等特性，使得甘薯基础研究严重滞后，新品种培育和品质改良十分困难。
2019年9月23日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心张鹏研究组在International Journal of Molecular Sciences杂志上在线发表了题为“CRISPR/Cas9-Based Mutagenesis of Starch Biosynthetic Genes in Sweet Potato (Ipomoea batatas) for the Improvement of Starch Quality”的研究论文。该研究首次利用CRISPR-Cas9技术在六倍体甘薯中实现了定点编辑，获得了高直链和蜡质淀粉，为食品加工及工业应用提供新型原材料, 也为今后甘薯的育种提供了新的思路和技术。我公司参与了该项目，市场部经理吴银亮为该文章并列一作。
在本研究中，该团队选取了两个甘薯主栽品种：淀粉型品种“徐薯22”和富含类胡萝卜素的品种“泰中6号”（ 图1）作为受体植物，针对淀粉生物合成途径基因IbGBSSI和IbSBEII分别设计了两个sgRNA靶点，对应构建了单个和双个sgRNA靶点的CRISPR / Cas9载体（图1a,b,c）。在该载体系统中，sgRNA采用拟南芥U6启动子启动；Cas9蛋白采用UBQ启动子。终载表达载体采用pCAMBIA 1301S载体，带潮霉素筛选抗性。针对甘薯IbGBSSI基因，文章挑选了位于74-93bp处和292-311bp处作为特异靶点，两个靶点均位于基因第一个外显子上；IbSBEII基因选取了6814-6833bp处作为靶点1，位于第12个外显子上，第二个靶点位于第15个外显子（9471-9490bp）处。单靶系统只带有单一靶点；双靶系统带有2个特异性靶点。
图1 载体及sgRNA示意图
在分别转化对应甘薯栽培种品系后，为验证基因编辑效率，故对转基因株系进行了分析。研究人员提取了转基因株系的基因组，首先通过Cas9基因扩增，验证株系的阳性与否。同时在在目的靶点上下游分别设计PCR扩增引物进行扩增，根据条带大小初步判定编辑效果：单带：可能发生点突变、移码突变或无突变；双带（一大一小）：可能发生了大片段删除。分别回收对应PCR产物进行测序，对测序结果分析表明，CRISPR / Cas9系统在甘薯基因组中达到良好的基因编辑效果，突变率达到了63%以上（Table 1）。，在单靶体系和双靶体系中均发现了多种形式的编辑结果，如替换、插入突变、删除突变；在双靶体系中同时也检测到了大片段删除，最长可删除2658bp（图2，图3）。因为甘薯是异源六倍体，理论上存在六条独立染色体，为了弄清基因编辑的具体位置和效率，研究者又进一步对编辑位点进行了定位，通过多态位点分析，可以精确定位到编辑位点位于第几号染色体上（图4）。
图2 基因编辑分析示意图
图3 基因编辑效果形式及定位
图4 编辑位点染色体定位分析 由图可知，1-24株系编辑位点位于2号染色体上
为了更进一步验证目标基因编辑后的效果，研究者对淀粉理化性质进行了检测，发现虽然被编辑的植株总淀粉含量不变，但直链淀粉和支链淀粉的含量及链长发生了显著的变化（图5, 图6a, 6b）。其中GBSSI基因编辑的材料直链淀粉明显下降，支链淀粉含量上升；SBEII基因编辑的材料直链淀粉明显上升，支链对应下降（图5）。更进一步对链长分布进行分析，离子色谱分析结果显示，在GBSSI转基因材料中，短链有明显的增加，长链减少；对应的SBEII材料中，短链则明显减少，长链增加（Table 2，图6a）；凝胶色谱对超长链进行分析，结果显示在DP200以后，SBEII基因编辑材料链长远高于野生型，GBSSI材料则相反（图6b）。
图5 直链淀粉含量结果
图6 链长分布结果
综上，该研究首次实现CRISPR/Cas9编辑甘薯淀粉合成基因改良了淀粉的品质，为今后甘薯分子育种及多倍体作物基因编辑提供了新方向。
文章链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/20/19/4702
