行业动态

研究材料：杨树幼苗根系、拟南芥

技术方法：转录组学、遗传转化、RT-PCR、体外相分离

技术路线：

技术路线图

1.PagPCaP1a与杨树的盐胁迫响应密切相关

作者用200 mM NaCl溶液灌溉组织培养生长的植物6小时、12小时、24小时，对照组植物仅用水灌溉，然后收集植物根部进行转录组测序及组间差异分析（图1A、B）。其中最为重要得是GO注释描述为编码质膜锚定蛋白的基因，Potri.003G157100，属于PCaP家族。杨树基因组包含两个PCaP1基因，分别称为PagPCaP1a和PagPCaP1b（图1C）。PagPCaP1a和PagPCaP1b表现出相似的表达模式，在幼叶和茎中显示出一些表达，而在幼根和成熟根中显示出相对较高的表达水平（图1D）。然而，与PagPCaP1a不同的是，PagPCaP1b的表达水平在盐胁迫下基本保持不变甚至略有下降。RT-qPCR分析验证了这一结果（图1E）。以上结果表明，PagPCaP1a可能参与了杨树的盐胁迫响应。

图1 盐胁迫的杨树苗中PagPCaP1b的鉴定和表达分析

2.PagPCaP1b会影响杨树的盐胁迫适应性和微管稳定性

为了评估PagPCaP1a在杨树中的潜在生物学功能，通过遗传转化实验选择了三个PagPCaP1a过表达系（PagPCaP1a-OE）和一个PagPCaP1a基因的突变体。用200 mM NaCl灌溉种植在土壤中的3个月大的WT、Pagpcap1a突变体和OE转基因植物进行为期两周盐胁迫处理，用水作为对照。

PagPCaP1a-OE植物的叶子比WT叶子更萎蔫，而Pagpcap1a突变体植物比WT表现得更好（图2A）。与WT植物相比，PagPCaP1a-OE植物显示出相反的表型，表现出较低的RWC和叶绿素含量以及较高的MDA含量（图2B至D）。同时，在拟南芥的PagPCaP1a转基因互补系（Com#1和Com#2）的存活率低于拟南芥pcap1突变体，恢复到WT（拟南芥品系Col-0）中观察到的水平（图2E和F）。这些发现表明，PagPCaP1a负调控杨树对盐胁迫的响应，其功能在拟南芥中是保守的。

由于PagPCaP1a同源物直接调控微管，为此将15天大的杨树幼苗浸泡在含有200 mM NaCl的液体半强度Murashige和Skoog（MS）培养基中4小时或8小时，使用转移到含NaCl的培养基之前的幼苗作为0小时对照。通过对β-微管蛋白进行免疫染色观察WT、Pagpcap1a和PagPCaP1a-OE#1系中根细胞的皮层微管组织。在暴露于NaCl后，所有基因型的微管密度显著下降（图2G）。特别是，与WT细胞相比，Pagpcap1a细胞中的微管密度下降缓慢，而PagPCaP1a-OE#1细胞中的微管密度下降更快。

为了评估PagPCaP1a对微管的生化功能进行了体外共沉淀实验。从大肠杆菌中生产并纯化了His-PagPCaP1a，并将其与预先形成的Taxol稳定微管一起孵育，His-PagPCaP1a与Taxol稳定微管混合导致大部分PagPCaP1a与微管一起在沉淀中被回收（图2H）。这一结果表明PagPCaP1a直接结合到微管上。另外通过可视化由罗丹明标记的微管蛋白预聚合的微管，单独或在存在PagPCaP1a的情况下，研究了PagPCaP1a对微管动态的影响。显微镜观察表明，与仅观察微管的情况相比，加入His-PagPCaP1a后存在的微管较少（图2，I和J）。这些结果表明，PagPCaP1a作为一个微管不稳定化蛋白，参与了盐胁迫诱导的微管重组。

图2 PagPCaP1b会影响杨树的盐胁迫适应性和微管稳定性

3.PagPCaP1a在盐胁迫下在细胞中形成生物分子凝聚物

鉴于PagPCaP1a在盐胁迫响应中的作用，作者评估了PagPCaP1a在正常生长条件下或暴露于盐分压力下的细胞中的亚细胞定位。通过农杆菌介导的浸润将编码PagPCaP1a-mCherry的构建体浸润到烟草（Nicotiana benthamiana）叶中。确定PagPCaP1a-mCherry在盐胁迫下形成诱导的凝聚物，与其在正常条件下的质膜定位相反（图3A）。进一步研究PagPCaP1a在盐胁迫下的杨树中的定位，结果发现，在对照条件下，PagPCaP1a-GFP主要定位在质膜上，并在盐处理10分钟后迅速在细胞质中形成凝聚物（图3B）。

为了确定PagPCaP1a凝聚物是否表现出液体样特性，在杨树原生质体中的PagPCaP1a-GFP凝聚物上进行了光漂白后荧光恢复（FRAP）实验。在实验后，PagPCaP1a-GFP迅速从未漂白区域重新分布到漂白区域（图3，C和D），这表明这些凝聚物具有液体样状态。此外，PagPCaP1a-GFP在转基因拟南芥proAtPCaP1:PagPCaP1a-GFP/pcap1互补幼苗的根细胞中暴露于盐处理后迅速在细胞质中形成凝聚物（图3，E和F），这些凝聚物在FRAP分析下也表现出类似的液体样特性（图3，G和H）。总之，这些观察表明，PagPCaP1a蛋白在响应盐胁迫时在体内形成具有液体样特性的凝聚物。这些数据表明，PagPCaP1a蛋白可以形成动态的凝聚物，这种行为可能与液-液相分离（LLPS）有关。

为了确定盐诱导的PagPCaP1a凝聚物形成是否依赖于Ca²⁺，在将proAtPCaP1:PagPCaP1a-GFP/pcap1转基因幼苗暴露于200 mM NaCl之前，先用300 μM BAPTA-AM（一种可透过细胞的Ca²⁺螯合剂）预处理30分钟，单独或在存在BAPTA-AM的情况下暴露于NaCl。暴露于盐胁迫后，BAPTA-AM大大损害了PagPCaP1a凝聚物的形成（图3，I和J）。类似地，钙通道阻断剂LaCl3抑制了根细胞中PagPCaP1a凝聚物的形成（图3，K和L）。这些结果表明，盐诱导的[Ca²⁺]cyt升高在体内PagPCaP1a凝聚物的形成中起着关键作用。

图3 PagPCaP1a响应盐度胁迫而经历可逆和动态凝聚

4.PagPCaP1a在体外进行LLPS

内在无序区域（IDRs）在进行LLPS的蛋白质中很常见，介导生物分子凝聚物的形成。生物信息学分析表明，PagPCaP1a很可能含有IDRs（图4A）。在室温下在有或没有NaCl的情况下孵育纯化的重组PagPCaP1a-GFP，没有任何样本显示出蛋白质溶液的浊度。在反应中加入了CaCl2形式的Ca²⁺产生了指示LLPS的浊溶液（图4B）。为了确认Ca²⁺在PagPCaP1a相分离中的作用，在存在NaCl或CaCl2的情况下进行沉淀实验，通过离心分离可溶部分和凝聚相（沉淀），随后进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，确定了加入Ca²⁺促进了PagPCaP1a-GFP凝聚相（沉淀）的形成（图4C）。对浊溶液的显微镜观察显示，PagPCaP1a-GFP/-mCherry形成微米级的凝聚物（图4D）。

体外相分离实验通过系统地改变Ca²⁺和重组PagPCaP1a-GFP的浓度来生成相图，以评估促进凝聚物形成的条件（图4E）。随着Ca²⁺（0到10 mM）或蛋白质（5到150 μM）浓度的增加，形成的凝聚物更大且数量更多（图4，F到H）。使用时间序列显微镜观察到单个PagPCaP1a凝聚物的融合，形成了更大和更球形的蛋白质体（图4I）。FRAP实验显示，漂白后的PagPCaP1a-GFP凝聚物的荧光信号在90秒内恢复到接近光漂白前的值（图4，J和K）。这些结果表明，PagPCaP1a-GFP凝聚物具有LLPS所必需的动态特性。

图4 PagPCaP1a在体外进行LLPS

5.PagPCaP1a通过其VEEEKK基序部分以依赖Ca²⁺的方式进行LLPS

VEExK基序是一个潜在的Ca²⁺结合位点，并且对拟南芥中Ca²⁺介导的PCaP1功能至关重要。作者突变了VEEEKK基序中的三个氨基酸，创建了mPagPCaP1a变体（图5A）。在体内的相分离实验中，将PagPCaP1a-mCherry或mPagPCaP1a-mCherry构建体浸润到N. benthamiana细胞中，发现PagPCaP1a-mCherry和mPagPCaP1a-mCherry在对照条件下均定位在质膜上。然而，在暴露于盐胁迫时，PagPCaP1a-mCherry形成了可见的凝聚物，而mPagPCaP1a-mCherry则没有（图5B）。进一步通过在Pagpcap1a突变体杨树获得的原生质体中瞬时表达proPagPCaP1:mPagPCaP1a-GFP或proPagPCaP1:mPagPCaP1a-mCherry来确认这些结果（图5C）。

此外，将proAtPCaP1:mPagPCaP1a-GFP转基因引入到拟南芥pcap1突变体背景中（指定为mCom#1和mCom#2）。在mCom#1和mCom#2幼苗的根细胞中，即使在盐处理条件下，mPagPCaP1a-GFP仍保持其质膜定位（图5D），这与在杨树细胞中的观察结果一致。此外，proAtPCaP1:mPagPCaP1a-GFP无法补偿拟南芥pcap1突变体在盐分压力下更高存活率的表型（图5，E和F）。这些发现揭示了依赖Ca²⁺的相分离对于PagPCaP1a蛋白在幼苗响应盐分压力时的功能至关重要。

为了研究VEEEKK基序在PagPCaP1a相分离中的重要作用，作者检测了mPagPCaP1a在体外的相分离。在相同浓度的Ca²⁺存在下，mPagPCaP1a的浊度与PagPCaP1a相比显著降低（图5，G和H）。对溶液的显微镜观察显示，mPagPCaP1a只能形成散乱的、不规则形状的聚集体，因此其相分离能力大大降低（图5，I至K），证实了Ca²⁺对PagPCaP1a相分离的重要作用。

图5 VEEEKK基序对Ca²⁺介导的PagPCaP1a相分离至关重要

6.PagPCaP1a凝聚物在盐胁迫下增强微管解聚的效率

由于PagPCaP1a在盐胁迫下使微管不稳定并形成蛋白质凝聚物，因此作者研究了PagPCaP1a凝聚物存在下微管的行为。PagPCaP1a-mCherry和MBD-GFP在本氏烟草细胞中瞬时共表达。共聚焦显微镜显示，当细胞暴露于200 mM NaCl时，大多数PagPCaP1a-mCherry凝聚物与微管共定位（图6A）。为了证实这些结果，进一步培养了共表达PagPCaP1a-GFP和mCherry微管蛋白的转基因拟南芥植物。在这些植物中，PagPCaP1a-GFP凝聚物与mCherry微管蛋白标记的皮质微管共定位，特别是在用NaCl处理的细胞中（图6B）。因此，PagPCaP1a凝聚物在盐胁迫下定位于微管。

接下来，研究了PagPCaP1a凝聚物对微管组织的影响，方法是使用由罗丹明标记的微管蛋白聚合的微管，并将其与重组纯化的His-PagPCaP1a或His-mPagPCaP1a一起孵育。在没有Ca²⁺的情况下，与对照相比，PagPCaP1a或mPagPCaP1a的存在下微管的密度降低，PagPCaP1a和mPagPCaP1a之间没有显著差异。在Ca²⁺存在的情况下，PagPCaP1a存在下的微管密度显著低于mPagPCaP1a存在下的微管密度（图6C）。微管密度的量化表明，PagPCaP1a凝聚物在Ca²⁺存在下可以加速微管解聚约两倍，与没有Ca²⁺且没有相分离的条件相比（图6D），这表明PagPCaP1a的LLPS加速了微管解聚。总之，这些结果表明，盐分压力诱导PagPCaP1a的LLPS，这些凝聚物定位到微管上以促进其解聚，从而影响植物的盐耐受性。

图6 PagPCaP1a凝聚物在盐胁迫下增强微管解聚的效率