TNF 抑制剂已被用于治疗自身免疫性和自身炎症性疾病，白塞病（BD）是一种自身免疫性炎症性疾病。
2024年4月发表在Nature Communication上的题为“TNF inhibitors target a mevalonate metabolite/TRPM2/calcium signaling axis in neutrophils to dampen vasculitis in Behçet's disease”的文章中，作者使用血清代谢组学和外周免疫细胞转录组学，发现BD患者的多形核中性粒细胞 （PMN） 具有失调的甲羟戊酸通路，法呢基焦磷酸（FPP）水平升高，最终发现了 FPP-TRPM2-TNF/NETs 反馈回路对炎症加重的影响，以及TNF抑制剂治疗对BD的新见解。
研究对象：临床BD患者和健康对照血清、PBMC、PMN，小鼠
技术方法：代谢组、脂质组、转录组、单细胞转录组、炎症因子检测、基因敲除小鼠构建、免疫荧光染色等
技术路线：
1.多组学分析强调了 MVA 通路在 BD-PMN 过度激活中的促炎作用
作者整合了已发表的多组学的数据，包括BD患者和健康对照的血清代谢组，脂质组，PBMC和PMN的转录组测序，PBMC的单细胞RNA测序。结果表明，与HC相比，BD血清中的类固醇生物合成途径显著上调（图1A）,单个免疫群的分析结果显示，血清中的这种代谢改变主要发生在BD-PMN中（图1B）。类固醇的下游通路中，BD-PMN 的胆固醇生物合成途径显著增加，但胆汁酸和类固醇激素的合成途径却没有增加（图1C）。随后，作者从BD-PMN和HC-PMN的转录数据检查了胆固醇生物合成途径中关键酶的表达谱，并在独立的20例BD患者队列中通过qRT-PCR的方法进行了验证（图1D），结果显示，表达差异最大的酶，包括ACAT1、MVK、PMVK 和MVD，都集中在胆固醇生物合成的上游途径，即 MVA 途径（图1E）。
这些结果表明，BD-PMN 中的 MVA 通路发生了特异性上调。
图1 多组学分析凸显了BD患者中MVA途径的上调
为了确定MVA通路的作用，作者通过使用辛伐他汀和唑来膦酸分别抑制了控制 MVA 通路起点和终点的酶（图1E），结果显示两种抑制剂都能抑制BD-PMN的促炎细胞因子（图2A-B）。MVA 通路的最终产物是法尼基焦磷酸（FPP），由GPP转化而来，作者推测FPP可能是参与MVA通路诱导BD-PMN超活化的主要成分。为了验证该假设，作者分别抑制和激活了通路关键酶角鲨烯合成酶（FDFT1）的功能，结果表明，FPP在细胞内的积累增加了BD-PMN中促炎细胞因子的产生，反之亦然（图2C-E），且对PMN的活力无影响，这表明 FPP 在 PMN 中具有促炎作用。
这些结果表明，MVA通路，尤其是其代谢产物 FPP，在PMN活化和炎症中起着促炎作用。
图2 FPP是BD-FMN炎症中的关键代谢物
2.BD患者的FPP水平升高且与疾病活动相关
作者通过靶向代谢的方法进一步检测了FPP在血清和PMN样本中的丰度，与HC相比，活动性BD患者的两种样本中的FPP相对水平均升高（图2F），纵向随访数据表明，在BD患者有所缓解后，PMN和血清中的FPP水平显著下降（图2G-H）。临床数据的评估结果显示，PMN中的FPP水平与C反应蛋白（CRP）呈正相关，而血清中的FPP水平则与CRP和红细胞沉降率（ESR，BD疾病活动性的指标）均呈正相关（图2I，J），活动性高的患者样本中的FPP水平显著高于低活动性的患者，具有心外血管受累（包括深静脉血栓和动脉瘤）的BD患者的血清FPP水平明显高于心脏受累患者。ROC曲线的结果中，FPP的AUC值为0.7467。
这些结果暗示了FPP刺激下DAMPs介导的PMN炎症和坏死的直接效应。
3.BD-PMN对外源FPP的增强反应性促进了PMN的过度激活及血管内皮的炎症和损伤
作者在体外化学合成了FPP，并研究了其对PMN、淋巴细胞和单核细胞的促炎性细胞因子表达的影响，数据显示，PMN中促炎性细胞因子的产生增加，但淋巴细胞和单核细胞无影响，且D-PMN的反应性高于HC-PMN（图3A-D）。在FPP以剂量依赖的方式刺激了PMN中促炎性细胞因子的产生（图3E），且未影响其存活率，随着浓度增加，60 µg/mL FPP诱导了PMN、单核细胞和淋巴细胞的死亡，且BD患者PMN中的反应性更强（图3F-H）。与CRP正相关的NETs来源的dsDNA，在活动性BD患者中也显著高于HC组（图3I），随访结果表明，治疗后缓解期的BD患者血清NETs-dsDNA水平显著下降（图3J）。此外，60 µg/mL FPP刺激的BD-PMN上清液比HC的上清液引起了血管内皮细胞（VEC）的更强烈炎症反应，表现为促炎性细胞因子和黏附分子的上调（图3K）。
这些数据表明，FPP特异性触发PMN过度激活和VEC炎症，并增强BD-PMN的反应性。
图3 FPP对PMN过度激活和血管内皮炎症的影响
4.钙和TRP通道对于FPP诱导的PMN激活至关重要
FPP通过与瞬时受体电位（TRP）通道相互作用引发钙离子内流，进而引起基因转录和细胞免疫反应。为了验证钙离子的作用，作者在存在和不存在钙的情况下使用了通用抑制剂红钌（RR），这两种条件均抑制了FPP诱导的钙内流、细胞因子产生（图4A）和PMN的NETosis（图4B-D），这表明钙和TRP通道对FPP促进PMN过度激活至关重要。此外，RR显著减弱了FPP对NETosis诱导的VEC激活的影响（图4E）。NETs-dsDNA降解后，VEC中促炎性细胞因子和黏附分子的表达显著降低（图4C、E），这表明NETs是FPP刺激PMN上清液中诱导VEC炎症的关键成分。TRP通道介导了BD-PMN对FPP刺激的增强反应（图4F、G）。流式细胞术的结果显示，在FPP刺激下，BD-PMN比HC-PMN表现出更强的钙离子内流（图4H）。
这些结果表明，FPP诱导的PMN活化机制依赖于通过TRP通道的钙离子内流。
图4 FPP对FMN的促炎作用依赖于钙和TRP通道
5.TNF-TRPM2轴在PMN中引发了FFP诱导的炎症反应
RNA测序数据库中的RR敏感钙通道（TRP通道等）分析结果表明，四个基因（TRPM2、TRPC1、RYR1和MCOLN2）的表达显著升高（图5A），根据qRT-PCR和WB的结果（图5B-C），TRPM2是BD-PMN中FPP反应性增强的主要原因，且TRPM2的表达水平在活动期BD患者中显著高于缓解期（图5D），这暗示TRPM2可能参与BD的进展。BD-PMN中TRPM2的敲低显著改善了FPP诱导的BD-PMN过度激活，表现为促炎性细胞因子（图5E）、NETs（图5F-H）和VEC的炎症反应的降低（图5I）。
图5 TRPM2 表达升高参与了 FPP 诱导的 BD-PMN 炎症反应
使用活动期BD血清培养的HC-PMN的TRPM2表达水平显著高于使用HC血清培养的HC-PMN（图6A），促炎因子的结果中，BD血清中的TNF、IL-6和IFN-γ水平高于HC血清（图6B）。这些数据表明，只有TNF显著增加了PMN上的TRPM2表达（图6C-D），而其他细胞因子如IL-6、IL-18、IL-1β或IFN-γ则没有影响。
临床数据中，经过4个月左右的TNF抑制剂治疗，BD-PMN中的TRPM2表达显著降低（图6E），随访数据也表明，最后检测时间点的BD-PMN中，TRPM2表达显著低于基线水平。此外，体外实验表明，TNF抑制在BD血清中减少了FPP诱导的PMN活化（图6F-G）。
这些数据表明，TNF抑制剂的治疗可以通过下调BD-PMN中TRPM2的表达，减少FPP诱导的PMN活化。
图6 TNF-TRPM2轴在BD-PMN中引发FPP诱导的炎症反应
6.FPP-TRPM2-PMN轴参与小鼠血管炎和自身免疫性葡萄膜炎
为了进一步确认FPP在血管炎症和损伤中的关键作用，作者构建了FPP合成酶（FPPS）敲除小鼠，并诱导了血管炎症。与对照组相比，敲除鼠的血管炎症和损伤降低，表现为中性粒细胞浸润和血管通透性显著降低（图7A-D），敲除鼠皮肤组织中MPO阳性细胞的比例也明显低于对照小鼠（图7E-H）。此外，TRPM2全敲除（TRPM2-KO）小鼠与野生型对照小鼠相比，也表现出显著降低的血管损伤，血管通透性降低（图7I-K）。
这些实验结果表明，FPP-TRPM2-PMN轴在诱导血管炎症中的关键作用。
图7 FPPS和TRPM2敲除可有效减轻小鼠的中性粒细胞浸润和血管通透性
在这项研究中，作者通过多组学数据和一系列体外实验结果表明，TNF通过上调TRPM2的表达使PMN对FPP更敏感，而TRPM2的表达与FPP的促TNF和NETs生成效应一起，在BD中导致正向促炎反馈回路。该机制可能也会对其他自身免疫和自身炎症疾病产生影响。
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