肝细胞癌（HCC）是全球第四大癌症死亡原因，5年生存率仅为18%，传统的化疗药物在低剂量时效果较差，增加剂量往往伴随着毒副作用。因此，提高药物的敏感性是获得理想疗效的关键。中药多糖与化疗药物联用，疗效显著，不良反应少，越来越受到重视。
研究材料：醋炙柴胡、Huh 7（人肝癌细胞）、HepG2细胞、Bel7402细胞
技术方法：分子量、单糖组成、紫外和红外光谱、甲基化分析、核磁光谱、刚果红实验、细胞活力测定
技术路线：
实验思路图
1.醋炙柴胡中分离出三种多糖
分离纯化后，VRP3-3、VRP2-3和VRP2-4的产率分别为2.95 %、6.80 %、13.19 %（图1 A和B)。紫外光谱图(图1 C~E)显示VRPs中含有微量的蛋白质或核酸。三种多糖在SEC色谱图中分别显示出单一的对称峰(图2）这表明它们是均一的多糖。VRP3-3、VRP2-3和VRP2-4的分子量分别为16.05 kDa、95.35 kDa和57.90 kDa。VRP3-3和VRP2-3主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，VRP2-4主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成。
图1 多糖在DEAE纤维素52柱上的洗脱曲线及其紫外扫描。VRP2 (A)和VRP3 (B)的洗脱曲线；对VRP3-3 (C)、VRP2-3 (D)和VRP2-4 (E)进行紫外扫描
图2 VRP3-3、VRP2-3、VRP2-4的SEC (A~C)和FT-IR (D~F)谱图
2.红外光谱分析
红外光谱结果如图2所示，推测VRP3-3和VRP2-3为β-呋喃多糖，VRP2-4为β-吡喃酸多糖。
3.甲基化分析
甲基化结果如表1所示，根据甲基化分析的结果，在VRP3-3中鉴定了8个pmaa，在VRP2-3中鉴定了10个pmaa，在VRP 2-4中鉴定了7个pmaa，支化度分别为41.49 %、53.77 %和33.32 %。结果表明，t-Araf、1，5-Araf、1，3，5-Araf和1，4-Galp残基是VRP中普遍存在的连接，并且都是高度分支的多糖。
表1 VRPs的甲基化结果
4.核磁共振分析
VRP3-3被认为是高度分支的多糖，其特征以→1)-α-Araf-(5→,→1，2)-α-Rhap (4→和→1)-α-GalpA(4→为主链，带有少量的酯化和乙酰化基团，并且一些侧链连接Araf的O-3，Rhap的O-4（图3）；VRP2-3的主链为→1)- α-Galp(2→，→1)-β-GalpA(O-Ac)(4→，1，2)-α-Rhap-(4→，→1)-α-Araf-(5→和一些末端片段，包括t-α-Araf和t-β-Galp。侧链主要由1，4-β-Galp、1，3-β-Galp和1，6-β-D-Galp组成，分别连接在α-L-Rhap的O-4和α-L-Araf的O-3位（图4）。VRP2-4的骨架由以下部分组成→1)-α-Galp-(4→，1)-α-GalpA (OMe)-(4→，→1)-α-GalpA-(4→ and →1，2)- α-Rhap (4→,半乳糖醛酸残基上发生乙酰化。作为主要的侧链，→5)-α-Araf-(1→连接在α-Rhap的O-4位，还包括少量的t-α-Galp和t-α-Manp（图5）。
图3 VRP3-3核磁共振结果
图4 VRP2-3核磁共振结果
图5 VRP2-4核磁共振结果
5.高级结构分析
刚果红结果如图6所示，VRP2-3和VRP2-4没有三股螺旋结构，而刚果红+VRP3-3溶液中的λmax随着碱浓度的增加而显著移动，表明VRP3-3具有三股螺旋结构。
图6 高级结构
6.化疗药物以剂量依赖的方式抑制HCC细胞的增殖
紫杉醇(PTX)、甲氨蝶呤(MTX)和顺铂(DDP)对Huh7细胞的48小时抑制作用如图7，随着浓度的增加，抑制率相应增加。
7.VRPs显著增强化疗药物对HCC细胞增殖的抑制作用
在三种多糖中，VRP3-3与PTX、MTX和顺铂联合应用对Huh7细胞的协同作用最好，q值分别为1.40、1.16、1.83(图7 J-M)。
图7 多糖和化疗药物对肝癌细胞抑制率的体外联合作用
8.VRPs的结构组合效应关系分析
选择三种化疗药物与三种VRP联合应用，其中VRP3-3的增效作用最好，其次是VRP2-3，VRP2-4的增效作用最弱。同一来源的多糖活性差异很大，表明多糖的结构与其联合作用直接相关。目前已证明多糖的分子量、主链组成、侧链长度和高级结构与其活性密切相关。在这三种多糖中，VRP3-3的分子量较小，半乳糖醛酸含量较少，阿拉伯糖含量较高。相关性分析(图8)显示阿拉伯糖和葡萄糖的比例与结合活性呈正相关。与溶液中形成的多糖的粒径呈一定的正相关关系。甘露糖、鼠李糖和半乳糖醛酸似乎与组合活性负相关。而半乳糖对组合活性贡献很小。通过对三种多糖主链和侧链糖苷键类型的比较分析，我们发现了一些有价值的结构差。VRP3-3的主链主要由1，5连接的α-Araf组成，还有一小部分1，2，4连接的α-Rhap和1，4连接的α-GalpA。VRP2-3的骨架也由超过一半的1，5连接的-α-Araf，部分1，2连接的-α-Galp，1，4连接的-β-GalpA(O-Ac)和1，2，4连接的-α-Rhap组成。VRP2-4的主链主要由1，4连接的α-Galp、1，4连接的α-GalpA(OMe)、1，4连接的α-GalpA和1，2，4连接的α-Rhap组成。VRP3-3的侧链主要由1，6- β-Galp和1，3-β-Galp组成，VRP2-3主要由1，4-β-Galp、1，6-β-Galp和1，3-β-Galp组成，VRP2-4以1，5-连接的α-Araf为特征。有趣的是，VRP3-3具有三螺旋结构，而其他两种多糖没有。一般来说，中等分子量和三螺旋结构的多糖具有较好的生物活性。综上所述，我们可以初步推断，分子量约为16 kDa、主链中阿拉伯聚糖聚合度较大且具有三螺旋结构的VRP具有较好的结合活性。在三种多糖中，VRP3-3与PTX、MTX和顺铂联合应用对Huh7细胞的协同作用最好，q值分别为1.40、1.16、1.83(图7 J-M)。
图8 多糖结构与综合活性的相关性分析
综上所述，从VR中提取分离了三种均一的多糖，对三种多糖的结构鉴定和复合活性进行了研究，初步阐明了VRPs的构效关系，分子量约为16 kDa、主链中阿拉伯聚糖聚合度较大、具有三螺旋结构的多糖具有较高的活性。
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审核：三黍生物企宣部
