肝纤维化是多种肝病的最终阶段，抑制肝星状细胞(HSC)的激活对限制肝病纤维化至关重要。尽管对HSC激活机制的理解有所进步，但治疗纤维化的方案仍然有限。Gal-3是一个重要的治疗靶点，因为它能激活HSC。果胶是一种植物多糖，其中的RG-I阿拉伯半乳聚糖(AG)侧链有可能被Gal-3识别。Belapectin (GR-MD-02)是一种AG样果胶，正在进行3期临床试验以评估其抗肝纤维化作用，但目前仅通过静脉注射，口服效果未知。为了满足口服治疗的需求，研究者正在寻找其他Gal-3抑制剂。藏红花是一种昂贵的香料和草药，传统上用于治疗多种疾病，包括肝病。藏红花水提取物能减轻小鼠肝纤维化，但其多糖成分研究较少。
2024年10月，中国科学院上海药物研究所臧奕/丁侃/李佳，复旦大学药学院张雪梅团队在Carbohydrate Polymers发表题目为“A novelpectin-like polysaccharide from Crocus sativus targets Galectin-3 to inhibithepatic stellate cells activation and liver fibrosis”的研究论文，从藏红花中分离纯化得到一种具有抑制肝纤维化活性的果胶多糖（XHH2），并利用甲基化分析、部分酸水解、质谱和核磁共振谱等方法对其结构进行了表征。通过多肝星状细胞活化模型和四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型评价其抗纤维化作用。
研究材料：藏红花
技术方法：分子量分析、单糖组成分析、甲基化分析、核磁分析、糖醛酸还原、部分酸水解、多肝星状细胞活化模型、四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型
技术路线：
1.藏红花XHH2的分离与纯度分析
从藏红花干花中分离出名为XHH2的均质多糖，产率为0.123%，纯度达93.54%。通过高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）分析，得知XHH2的数均分子量、重均分子量和z均分子量分别为30.6 kDa、35.7 kDa和40.3 kDa，多分散指数为1.1661。单糖组成分析显示，XHH2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖按特定摩尔比组成。
图1 藏红花中XHH2的分离纯化方案
2.藏红花XHH2的结构表征
使用化学和光谱分析方法对XHH2进行结构表征，确定了其糖苷连锁模式和糖残基的连锁序列。根据表2，XHH2中的Ara以两种模式连接：T-Ara和1,5 -Ara。鼠李糖残基是1,2,4 -连接的Rha，而半乳糖则表现出多种连接，包括t-Gal、1,4 -Gal、1,3 -Gal、1,6 -Gal和1,3,6 -Gal。还原后，1,2,4 -Rha的水平在RXHH2和RXHH2I中都有明显的上升。这种增加被认为是源于原始XHH2多糖中1,2,4 - Rha的不完全甲基化，它与GalA连接。
通过核磁共振技术确定了XHH2和XHH2I糖残基的键型H-2向H-6和C-2向C-6的化学位移。对应的位移分别列在表3和表4中。结果显示，XHH2的主链和分支由特定的糖残基组成，具有复杂的结构特征。
图2 XHH2和XHH2I的1D和2D NMR谱。A. XHH2和XHH2I的13C NMR。B.XHH2和XHH2I的HSQC谱。C.XHH2和XHH2I的HMBC谱（红线：XHH2，蓝线：XHH2）
图3 XHH2重复单元的结构示意图
3.XHH2抑制TGF-β诱导的HSC活化
细胞实验表明，XHH2能显著降低HSC的代表性标志物水平，并抑制TGF-β诱导的HSC迁移和侵袭。这些结果表明XHH2具有抑制TGF-β诱导的HSC活化的能力。
图4 XHH2限制TGF-β诱导的肝星状细胞活化
4.XHH2抑制原代小鼠HSC的自激活
在正常和病理状态下分离的原代小鼠HSC实验中，XHH2均能剂量依赖性地抑制HSC的自激活。这些结果进一步证实了XHH2抑制HSC活化的能力。
图5 XHH2抑制原代小鼠肝星状细胞活化
5.XHH2通过Gal-3/integrin-β1/FAK途径抑制HSC活化
研究发现，XHH2容易与Gal-3结合，并通过干扰Gal-3与Integrin β1之间的互作来抑制HSC活化。进一步探索发现，Integrin β1/FAK信号通路参与了XHH2对HSC活化的抑制作用。
图6 XHH2通过Gal-3/Integrin-β1/FAK通路抑制HSC的活化
6.XHH2保护小鼠肝脏免受CCL4诱导的肝损伤和肝纤维化
急性毒性研究表明XHH2具有低毒性，可进一步进行药理评价。在CCL4诱导的肝纤维化模型中，XHH2改善了小鼠的肝损伤，减少了ECM的沉积，抑制了HSC的活化，从而减轻了肝纤维化。综上所述，XHH2具有显著的抗肝纤维化作用。
图7 XHH2对四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化的影响
作者首次从藏红花中分离纯化出果胶样多糖XHH2。XHH2结构独特，主链由1,3,6-Gal和1,3,4-GalA组成，O-3和O-4位置有分支，且含半乳聚糖而非典型RG-I果胶的AG分支，可能对Gal-3有潜在亲和力。功能上，XHH2能强效抑制Gal-3、HSC活化和肝纤维化，体内2mg/kg剂量即有效，且小鼠急性毒性试验表明其高达500mg/kg剂量下安全。与其他Gal-3抑制剂相比，XHH2具有选择性和口服疗效。研究还揭示了Gal-3与整合素-β1相互作用的新机制，阐明了HSC中下游FAK信号调节，强调了XHH2作为抗肝纤维化活性成分的潜力，可作为经典药物治疗的补充。
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