肝脏极易受到损伤，但目前关于肝脏损伤的治疗药物仍有缺陷，因此以饮食为基础的干预措施来预防或治疗肝脏损伤受到了越来越多人关注。玉米丝是肝保护食品的重要来源，但其主要由纤维素组成，常规水提醇沉法难以将其完全提取出来。植物乳杆菌是一种异发酵的嗜微氧革兰氏阳性微生物，具有高抗氧化能力和肝保护作用，在其基因组中编码多种糖苷酶，主要来自糖基水解酶家族，其中α-淀粉酶、β-木糖苷酶和阿拉伯糖尿苷酶均可切断半纤维素的糖苷键，因此植物发酵有助于降解和释放玉米丝多糖，更加安全高效。
本文旨在建立一种通过热水提取结合植物乳杆菌发酵生产玉米丝多糖的方法，并研究其对急性肝损伤的治疗潜力，并利用该策略，通过柱层析法获得并纯化了两种高支化的多糖，采用HPGPC法测定其分子量分布，通过结合甲基化-气相色谱-质谱和核磁共振的方法对其化学结构进行了详细的表征，在CCl4诱导的小鼠模型上评价了其对急性肝损伤的作用，并讨论了其构效关系。
研究对象：干玉米丝、植物乳杆菌、AML-12（小鼠肝实质）细胞
技术方法：分子量、单糖组成、粘度、紫外光谱、红外光谱、电镜、热重分析、甲基化分析、核磁光谱、细胞活力测定
技术路线：
图1 实验思路
1.多糖的理化表征
玉米丝多糖经过除杂（D301R树脂）、DEAE纯化后，得到F-CSP-W和F-CSP-S两个组分（图2a），分子量分别为4818 Da和9772 Da。
图2 玉米丝多糖的纯化和分子量结果
F-CSP-W的粘度测定为11.59 mPa.s，在浓度为5 mg/mL时，F-CSP-S的粘度值为10.75 mPa.s。紫外光谱在200~800nm范围内呈光滑曲线，在250~300nm处吸收较弱，表明馏分中存在少量杂质（图3a）。热重分析结果（图3b、c）发现，降解过程可分为三个阶段，首先，在30-200◦C之间观察到大约10 %的重量损失，并由于结合水的损失而出现明显的吸热行为。其次，F-CSP-W在224-284◦C时重量显著下降（40 %），而F-CSP-S在222-356◦C时由于高温分解，导致环单元破碎，产生水和挥发，进一步表明，当温度低于200◦C时，F-CSP-W/S保持稳定。红外光谱结果显示，F-CSP-W与F-CSP-S之间的FT-IR光谱无明显差异（图3e)。F-CSP-W/S的XRD模式在20◦（2θ）处显示出宽的衍射峰，表明多糖的非晶聚合结构（图3d)。
图3 F-CSP-W和F-CSP-S的化学和物理表征
2.多糖的结构表征
F-CSP-W主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、GlcN和Man等组成；而F-CSP-S主要由Glc、Gal、Xyl、Ara、次要GlcA、GalA、Man、Rha和GlcN等单糖组成（图4）。甲基化分析，结果表明，F-CSP-W主要由1→4-Glcp、1→4-Xylp、1→6-Glcp、1→3-Glcp和1→2-Xylp组成，含有少量的1→2-Arap，分支为1→5-Arap（表1）。F-CSP-S主要由1→4-Glcp组成，分支为1个→4,6-Glcp。其中，Glcp的数量显著减少，而Xylp和Galp的残基数量显著增加，表明其分支度高于F-CSP-W（表2）。
图4 F-CSP-W和F-CSP-S的单糖组成
表1 F-CSP-W的甲基化结果
表2 F-CSP-S的甲基化结果
采用核磁进一步分析F-CSP-W和F-CSP-S的结构（图5和图6），F-CSPW和F-CSP-S主要由α-1→4-Glcp、β-1→4-Xylp、α-Araf和α-Galp组成；此外，根据目前的信息，这两个组分都具有高度的分支结构。侧链被认为是阿拉伯木聚糖的溶剂化结构域，阿拉伯木聚糖是禾本科植物中主要的半纤维素，与植物乳杆菌容易获取的糖苷酶底物相一致，其结构特征被确定为β-1→4-Xyl骨架，α-Ara和4-O-Me-α-t-Glcp UA分支被取代。此外，F-CSP-S具有更复杂的果胶样侧链与阿拉伯木聚糖共价结合，其中含有α-1→4-GalUA和1→2-Rhap部分甲基酯化的典型残基（表3）。
图5 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁解析
表3 F-CSP-W和F-CSP-S的核磁结果
图6 F-CSP-W和F-CSP-S的糖链连接方式
3.对四氯化碳致急性肝损伤的肝保护作用
通过评价自由基活性氧的清除能力、四氯化碳诱导的急性肝损伤后肝脏指数和血清ALT和TBIL、H&E染色法和TUNEL染色法发现，首先，发酵并不影响玉米丝多糖的活性，因为发酵和未发酵的多糖都具有抗氧化和保护肝的活性；其次，Zhang等人证实了玉米丝多糖通过线粒体凋亡途径保护乙醇诱导的肝细胞损伤，从而抑制caspase级联反应。因此，这些多糖的肝保护作用可能部分独立于其抗氧化能力；最后，根据不同来源肝保护多糖的结构比较，主干中Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖侧链的抗肝损伤作用，但葡萄糖醛酸的分子量分布和含量与活性无关。
图7 F-CSP-W/S的体外抗氧化活性和肝保护活性
图8 多糖对四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠急性肝损伤的疗效
综上所述，从玉米丝中提取，有效地提取了两种高分支多糖。与仅用热水提取相比，产量提高了约3倍，显示出工业规模多糖生产的高潜力。结构分析发现，F-CSP-W/S主链为α-1→3-Galp，分支为α-1→4-Glcp，阿拉伯木聚糖的溶剂化结构域主要由β-1→4-Xyl、α-Ara和4-O-Me-α-t-GlcpUA作为侧链组成。F-CSP-S具有较高的分支度，果胶样侧链与阿拉伯木聚糖共价结合。此外，F-CSP-W/S是预防和治疗急性肝损伤的有效药物，为功能性食品的开发提供了坚实的基础，且Gal和Glc的含量以及阿拉伯木聚糖的侧链在发挥肝保护作用中均起关键作用，而其他结构特征则不相关。
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