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一起来看这篇以天然多糖为研究对象的Carbohydrate Polymers文章是如何设计的吧！

背景

骨关节炎（OA）是一种以以软骨损伤为特征的退行性关节疾病，主要影响老年人。骨性关节炎的发病机制现在被广泛理解为涉及软骨成分的改变，和对机械损伤的易感性的增加。随着时间延长，会导致软骨的渐进性侵蚀和结构完整性受损。临床研究表明，长期使用糖皮质激素地塞米松（Dex）可增加患骨关节炎的风险，甚至可能加速骨关节炎患者的疾病进程。因此，寻找新的、安全、有效的天然产品来治疗骨关节炎愈加重要。浙江金线兰（Anoectochilus zhejiangensis ，AZJ），又称“万灵药”，具有增强免疫功能、抗氧化、抗肝、降血糖、抗肿瘤、降压、抗炎和抗关节炎作用，但目前关于AZJ的研究非常有限。因此，从AZJ中发现和评价新型多糖是一个具有巨大潜力的研究领域。

本文从浙江金线兰中成功提取纯化了4种新型均质多糖AZJP- 1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c，对多糖结构进行表征，包括原子力显微镜（AFM）、刚果红分析、场发射扫描电镜（FESEM）、气相色谱-质谱甲基化分析和核磁共振波谱，还利用转基因荧光斑马鱼模型评估了软骨修复活性，为其软骨保护潜力提供了有价值的见解，并强调了其多糖的结构多样性。

研究材料：浙江金线兰、荧光斑马鱼模型

技术方法：多糖纯度、蛋白含量、分子量、单糖组成、甲基化分析、核磁分析、原子力显微镜（AFM）、刚果红实验、场发射扫描电镜（FESEM）、动物实验

技术路线：

图1 实验思路

1.AZJ多糖的分离

AZJ经DEAE-52纤维素柱分离纯化后得到AZJP-1、AZJP-2、AZJP-3和AZJP-4。将AZJP-1、AZJP-2再次通过G-200柱纯化，然后浓缩、透析、冷冻干燥得到4个纯化多糖，分别命名为AZJP-1a（图2B）、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c（图2C），总糖含量均高于95%，蛋白含量较低，可忽略不计。

图2 AZJ的分离纯化

2.分子量

用HPGPC法测定了多糖的分子量和纯度。如图3A所示，AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c表现出均匀、对称的特征峰，保留时间不同，这表明这四种多糖具有较高的纯度，且分子量分别为387.083 kDa、947.069 kDa、3.989 kDa和3.045 kDa。

图3 AZJ中多糖的化学特征

3.单糖组成

AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的单糖组成如图3B所示，AZJP-1a主要由甘露糖（96.10 %）组成，其次是少量半乳糖（2.83 %）、葡萄糖（0.64 %）、阿拉伯糖（0.27 %）和半乳糖醛酸（0.15 %）；AZJP-2a是一种杂多糖，主要由半乳糖（53.22 %）、阿拉伯糖（23.46 %）、葡萄糖（19.47 %）组成；AZJP-2b与AZJP-2a具有相似的单糖组成，AZJP-2b中葡萄糖（84.17 %）的含量显著高于AZJP-2a，而AZJP-2b中半乳糖（11.32 %）、甘露糖（0.63 %）、阿拉伯糖（3.52 %）、半乳糖醛酸（0.16 %）和葡萄糖醛酸（0.19 %）的含量相对低于AZJP-2a。AZJP-2c主要由葡萄糖（97.59 %）和少量的半乳糖组成。

4.刚果红三螺旋结构分析

刚果红实验结果如图4a所示，AZJP样品的最大吸收波长在任何氢氧化钠浓度下都没有明显的红移，说明AZJP都不具有三螺旋结构。场发射扫描电镜（FESEM）表明，AZJP-1a表现出球形和网状结构，表面孔隙数量增加，可能是由于多糖内存在广泛的支链相互作用。相比之下，AZJP-2a表现出粗糙、致密、呈现球形和网状结构，孔隙更少、更小，表面聚集不规则，这些特征表明，AZJP-2a具有较高的分子量和分支程度，导致糖链紧密相互作用。AZJP-2b显示出条带状结构，表面有可见的孔隙，有助于增强其水溶性。同样，在5000×放大下，AZJP-2c的表面有许多孔状结构，具有不规则的卷绕和细丝交联。虽然AZJP- 2b和AZJP-2c表现出卷曲的结构特征，通常有利于三螺旋的形成，但它们的低分子量可能破坏了氢键，阻止了这种结构的形成，这一观察结果与刚果红试验的结果一致。

原子力显微镜（AFM）如图4c所示，AZJP-1a主要表现为不规则的块状聚集物，以及短的、随机方向的链。AZJP-2a主要采用不规则的块状层状聚集物的构象，从其外围伸出长枝。AZJP-2b主要以一种柔性链为代表。同时，AZJP-2c主要以随机链为主，两侧伴有短分支。此外，从图4c中可以看出，这四种多糖的表面表现为一定程度的粗糙度，这是由多糖链相互作用的结果。在所有四种多糖中，形态显示的聚集体峰值明显高于单个多糖链的高度（0.1-1nm），表明分子聚集在所有样品中都普遍存在，这是由不同程度的分支和支链长度的差异导致的。

图4 AZJP-1a、AZJP-2a、AZJP-2b和AZJP-2c的形态学分析

5.多糖的化学结构分析

甲基化分析表明，.AZJP-1a的主要单糖残基包括Manp-(1→，Galp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Manp-（1→，→3,4）-Manp-（1→，→4,6）-Manp-(1→；AZJP-2a主要包括Araf-（1→→-（1→→3）-Araf-（1→→Glcp（1→→→→4）-1→→4）-Glcp（1→→3）-（1→→3、4）Glcp-1→→2,4）Glcp（1→→4,6）-Galp（1→→3,6）-Galp(1→；AZJP-2b由Glcp-(1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Galp-（1→，→4,6）-Glcp-（1→组成。AZJP-2c主要由Glcp-（1→，→4）-Galp-（1→，→4）-Glcp-（1→，→3,4）-Glcp-（1→，和→4,6）-Glcp-(1→组成，这些→以特定的序列排列。

表1 甲基化结果

核磁扫描解析结果，AZJP-1a的主链主要由→4)-β-D-Galp（1→、→3,4）-α-D-Manp（1→、→4,6）-β-D-Manp（1→和→4）-α-D-Manp(1→组成，侧链主要由α-D-Manp-(1→组成，少量α-D-Galp（1→链接在→3,4）-α-D-Manp（1→和→4,6）-β-D-Manp(1→的O-4，O-3和O-6位置（图5）。AZJP-2a主链由→4)-α-D-Glcp-(1 → 6)-β-D-Galp-(1→,→6)-β-DGalp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→,→3)-α-D-Glcp-(1 → 3)-α-D-Glcp-(1→, →3)- α-D-Glcp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-α-D-Glcp-(1→, →4)-α-D-Glcp-(1 → 2)-α-D-Glcp-(1→,→2)-α-D-Glcp-(1 → 3)-β-D-Galp- (1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 3)-β-D-Galp-(1→,→3)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-DGalp-(1→,and→4)-β-D-Galp-(1 → 4)-β-D-Galp-(1→,有不同长度的支链在不同的位置（图5）。AZJP-2b的主链主要由→4)-α-D-Galp（1→，→4）-α-D-Glcp（1→，→3、4）-β-D-Galp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→（图5）。AZJP-2c的主链主要由→4)-β-D-Galp（1→，→4）-α-DGlcp（1→，→3,4）-α-D-Glcp（1→和→4,6）-α-D-Glcp-(1→组成（图5）。

图5 核磁结果

6.斑马鱼模型中四种多糖对软骨的保护作用的评价

当幼虫暴露于从3 dpf到9 dpf的12.5 μM右美托咪定时，与正常组相比，颅面软骨的荧光强度明显下降（图6B）。当幼虫暴露于AZJP-1a、2a、2b和2c和阿仑膦酸钠（0.308 μM）时，观察到软骨细胞损伤的显著挽救（图6C-10O）。此外，斑马鱼幼虫颅面软骨的荧光强度也随着多糖浓度的变化而发生不同程度的变化。这一结果在很大程度上归因于多糖的复杂结构，其生物活性受到各种因素的影响，包括分子量、单糖组成、糖残基、连接模式和链构象。

图6 在9 dpf时，斑马鱼头部软骨的腹侧视图