近几年，机制研究一直受到高分期刊编辑青睐，那么对于中医药领域，是否能借鉴类似的思路，提高课题成果水平？
说到中药领域的机制研究，首先想到的研究对象必然是中药方剂。曾经，复杂的成分一直是阐释中药方剂作用机制的难点，而近几年，随着多组学技术的不断突破，这一研究困境正在逐步改变。
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糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病的一种常见且严重的并发症，以周围神经的脱髓鞘和轴突变性为特征，影响至少一半的糖尿病患者。除了最佳的血糖控制外，目前尚无特定治疗方法可以应对由糖尿病引起的周围神经损伤。即使严格的血糖控制也无法完全阻止或逆转DPN的进展。因此，有效的DPN治疗在临床实践中是一个重大挑战。尽管慢性高血糖会导致糖酵解升高和TCA循环紊乱，从而引起轴突变性和脱髓鞘，但中央碳水化合物代谢的整体视图及其在DPN病理条件下的生物能量串扰尚未完全阐明。
24年2月发表在Journal of pharmaceutical analysis上的题为“Targeted metabolomics reveals the aberrant energy status in diabetic peripheral neuropathy and the neuroprotective mechanism of traditional Chinese medicine JinMaiTong”的文章，作者监测旨在通过靶向代谢组学方法，全面了解DPN患者和链脲佐菌素（STZ）诱导的DPN大鼠的中央碳水化合物代谢概况。此外，探讨传统中药金脉通（JMT）对DPN的神经保护机制。
研究对象：DPN患者、健康对照组、RSC96细胞、雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠
技术方法：代谢组学分析、行为学和神经功能测试、形态学评估、Western blot分析、细胞实验
技术路线：
1.靶向代谢组学方法揭示了DPN患者和STZ诱导的DPN大鼠中央碳水化合物代谢的独特特征
作者为了获得与DPN相关的中央碳水化合物代谢特征的全景视图，开发了一种使用HPIC-QTRAP-MS/MS平台在25分钟内同时测定56种代谢物的靶向代谢组学方法（图1A）。在人类血清样本中，成功定量了41种靶向代谢物，通过PCA分析显示DPN患者和健康受试者的代谢谱显著不同（图1E）；与对照组相比，DPN患者中有25种代谢物显著变化（图2A）。后续又对大鼠的血清和坐骨神经组织进行检测，分别检测到52和50种代谢物，PCA得分图显示DPN大鼠和对照组在中央碳水化合物代谢方面有明显的聚类，特别是在血清样本中（图1E），血清和坐骨神经中分别有19和13种代谢物在组间显著不同（图2B）。KEGG通路分析显示，DPN患者的血清中TCA循环显著富集，其次是糖酵解/糖异生和戊糖磷酸途径（图2C）。
图1 使用高效离子色谱-串联质谱(HPIC-MS/MS) 进行靶向代谢组学分析，表征糖尿病周围神经病变 (DPN) 患者和DPN大鼠异常的中枢碳水化合物代谢
图2 糖尿病性周围神经病变（DPN）中代谢物显著变化的热图
2.中药金脉通JMT在改善DPN大鼠的外周神经功能方面的效果
使用STZ注射，构建DPN大鼠模型，大鼠在整个实验期间表现出持续且显著的血糖水平升高（图3A），STZ诱导的大鼠从第2周开始体重显著下降（图3B）。糖尿病大鼠机械痛阈值和运动神经传导速度（MNCV）显著降低而热响应潜伏期显著增加（图3C-F）。JMT和LA治疗显著改善了DPN大鼠的机械痛阈值、热响应潜伏期和动神经传导速度（图4C-E）。这些结果表明，JMT显著改善了DPN大鼠的外周神经功能。
图3 JMT改善DPN大鼠的周围神经功能并减轻周围神经的形态变化
3.JMT在减轻DPN大鼠坐骨神经形态学变化方面的效果
作者通过组织染色和透射电子显微镜多种染色和显微镜技术，展示了JMT在改善DPN大鼠坐骨神经形态学变化方面的显著效果（图3G-M）。这些结果不仅证实了JMT对DPN的神经保护作用，还为其在临床应用提供了重要的实验依据。
4.JMT在逆转DPN大鼠髓鞘和轴突蛋白表达减少方面的效果
作者使用免疫荧光染色检测背根神经节（DRG）中髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经丝重链（NF-H）的表达。发现JMT和LA治疗均显著增加了MBP和NF-H的表达，且JMT的效果优于LA（图3O和P）。这些结果表明JMT促进了DPN大鼠髓鞘和轴突的修复和再生。
5.JMT通过恢复DPN大鼠的中央碳水化合物代谢来发挥神经保护作用的效果
使用HPIC-QTRAP-MS/MS平台进行靶向代谢组学分析，检测56种代谢物。通过PCA得分图显示DPN和DPN+JMT组之间的完全分离，表明JMT治疗引起的代谢谱变化（图1E）；坐骨神经组织部分分离，表明JMT对坐骨神经代谢的影响。代谢物方面，与DPN模型组相比，血清样本中DPN+JMT组中有九种代谢物显著增加，三种显著减少，主要涉及TCA循环和戊糖磷酸途径（图4）。坐骨神经组织中DPN和DPN+JMT组之间有七种代谢物含量显著不同，其中三种是糖酵解途径的中间体（图4）。这些结果不仅证实了JMT可以通过恢复生物能量学来改善DPN，还为进一步理解JMT在DPN中的药理机制提供了重要依据。
图4 JMT治疗可恢复DPN大鼠循环和坐骨神经中紊乱的中枢碳水化合物代谢
6.JMT在体内激活了AMPK/PGC-1α信号通路
Western blot分析AMPK/PGC-1α信号通路相关蛋白的表达水平结果表明，JMT 通过激活AMPK/PGC-1α 信号通路改善了DPN大鼠模型中的线粒体功能障碍和神经病理损伤。JMT不仅促进了线粒体生物发生，还增强了线粒体呼吸功能和ATP生成能力。（图5）
7.JMT在减轻DPN大鼠线粒体形态学损伤方面的效果
作者使用TEM观察坐骨神经中线粒体的超微结构，JMT治疗逆转了这些形态学变化，线粒体形态恢复正常（图5J和K）。这些结果表明JMT治疗保护了坐骨神经中的线粒体免受糖尿病神经病变相关的形态学损伤，证实了JMT对DPN的神经保护作用，还为其在临床应用提供了重要的实验依据。
图5 JMT激活腺苷酸（AMP）活化蛋白激酶（AMPK）信号通路，减轻DPN大鼠坐骨神经（SN）线粒体的超微结构损伤
图6 JMT减轻高糖诱导的大鼠细胞系（RSC96）损伤
8.JMT通过AMPK途径促进高糖环境下RSC96细胞增殖并抑制其凋亡的效果
作者使用大鼠施万细胞系在高糖条件下培养，JMT以0.05 mg/mL的浓度与高糖共同处理72小时。使用流式细胞术分析发现，高糖显著增加了细胞的凋亡群体（图6A和B），JMT治疗显著减少了高糖引起的细胞凋亡，并增加了细胞的数量（图6C和D）。共处理JMT和CC（AMPK抑制剂）消除了JMT对细胞凋亡和细胞数量的影响，表明JMT的作用与AMPK激活有关。CCK-8实验则显示高糖显著抑制了细胞的增殖，而JMT逆转了这一效应（图6C）。
图7 大鼠细胞系 (RSC96) 中的线粒体呼吸功能和腺苷酸 (AMP) 活化蛋白激酶 (AMPK)/增殖激活受体γ辅激活因子1-α (PGC-1α) 信号相关蛋白的表达
9.JMT通过AMPK途径减轻高糖环境下RSC96细胞线粒体形态变化和呼吸功能障碍的效果
作者通过透射电子显微镜和Mito-tracker CMXRos染色等多种实验技术，表明JMT通过激活AMPK途径减轻高糖引起的RSC96细胞线粒体形态变化和呼吸功能障碍。JMT不仅改善了线粒体的超微结构和膜电位，还增强了线粒体的呼吸功能和ATP生成，从而有助于神经修复和再生（图6-7）。
10.AMPK抑制剂对JMT激活PGC-1α信号通路的影响
AMPK是细胞能量稳态的核心调控因子，在DPN中，AMPK的活性受到抑制。PGC-1α是AMPK的下游靶点，负责调控线粒体生物发生和功能。作者使用使用AMPK抑制剂 CC 来阻断AMPK活性，观察其对JMT调控 PGC-1α 的影响，通过 Western blot 和功能实验，明确了JMT 通过AMPK/PGC-1α 信号通路改善高糖诱导的线粒体功能障碍的作用机制（图7G-N）。
本文研究了JMT在DPN治疗中的作用机制，强调了其通过调控能量代谢和线粒体功能来实现神经保护的独特优势。研究表明，JMT 的疗效主要归因于其对AMPK/PGC-1α 信号通路的激活以及对施万细胞的保护作用。此外，JMT的多成分协同效应为其临床应用提供了广阔前景。然而，未来仍需进一步研究以明确其关键活性成分和作用靶点，推动其从实验室走向临床。
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排版：野凌
审核：三黍生物企宣部
