单细胞测序技术能够提供前所未有的细胞分辨率，揭示组织内不同细胞类型之间的异质性。其分析难点主要在于：如何从繁杂的数据中发现线索，并通过分析和后续湿实验来验证该线索。
因此不仅需要了解该疾病的病理过程（研究方向，如有药物还要了解药理等信息）、疾病相关组织的病理特点和过程、参与某个病理过程的细胞群及其功能表型、调控细胞群表型的分子和机制等信息，还需要了解验证某个线索需要用到的分析方法、实验方法以及该方法的优势和局限性。
在拥有单细胞测序数据后，如何有效地设计研究思路以最大化利用这些宝贵的信息呢？以下是一份基于单细胞测序数据分析的研究设计方案。
以特定细胞群为主要创新点的思路设计
对所有细胞进行分群和注释后，我们通常可以获得几个~十几个细胞类群，各个细胞类群也可以进一步细分为多个亚群。那么如何挑选目标细胞类群呢？基于已发表的经典文章可以归纳出以下策略。
如在免疫相关的单细胞研究中，T细胞等免疫细胞往往会被细分为多个细胞亚群，其中新的亚群可能起到关键作用，可作为肿瘤免疫治疗的新靶点。
2024年发表于Nature 的泛癌单细胞研究表明[1]，新的T细胞亚群—干细胞样CD4 T细胞在抗肿瘤免疫中发挥关键作用。
图1 在小鼠癌症模型中识别出TCF1+lin−干细胞样CD4 T细胞群体
在深入解析细胞亚群异质性时，单细胞测序技术的分辨率直接影响亚群鉴定的精准度。
10×单细胞转录组测序（3'端）采用优化标记策略，稳定捕获低丰度转录本，尤其适合干细胞样CD4 T细胞这类稀有亚群的基因表达图谱构建。
特有微流控分选系统，实现数千个细胞并行捕获，配合分析流程亚群聚类算法，表达模式差异较小的细胞亚型也能有效区分，为发现治疗新靶点提供可靠数据支撑。
| 三黍服务 | 技术参数 |
在发育分化、疾病进程、免疫应答等进程中，特定细胞类型的相对比例改变可能反映出细胞分化过程的变化。此外，细胞比例变化也可以反映组织内环境的稳态调节。在肿瘤研究中，不同细胞类型的比例变化可能与肿瘤侵袭、转移、免疫逃逸等密切相关。可重点关注在疾病中比例中“显著升高或者降低”的细胞群以及在疾病中功能相关的细胞群。
2.1 在疾病中比例“显著升高或者降低”的细胞群
挑选在不同比较组间细胞比例发生显著变化的细胞类型，这个细胞群在疾病组（或者干预组）比对照组（或者疾病组）的比例显著升高和降低。
图2 CAF亚群在多癌种中的细胞占比情况[2]
2.2 与疾病中功能相关的细胞群
如2024年发表在nature communications的文章中[3]，通过单细胞测序（主要技术）分析了CD（研究疾病类型）患者的末端回肠和升结肠细胞，发现了一种与CD相关的特殊上皮细胞类型“LND”（关键细胞群）能与免疫细胞相互作用，在CD活跃期中发挥作用。
图3 与克罗恩病相关的特殊上皮细胞类型的鉴定和多模式表征
疾病进程中细胞比例的动态变化是反映病理机制的核心，当研究聚焦于疾病相关细胞群体的功能解析时，多维度数据整合尤为重要。
针对疾病中显著波动的细胞群体，10×单细胞转录组测序（5'端）凭借其高分辨率的细胞分型能力，可准确识别丰度发生显著改变的细胞类型。
整合TCR/BCR分析模块，能精准量化不同细胞类型丰度差异，同步解析免疫细胞的克隆扩增特征，揭示免疫细胞克隆动态演变，为解析细胞比例变化机制提供关键线索。
| 三黍服务 | 技术参数 |
如2023年发表在nature communications的文章中[4]，为了识别 T2D 患者中可能失调的基因，对四种主要内分泌细胞类型（α、β、δ 和 γ 细胞）的病例和对照组进行了差异 ASE 分析，结果表明在2型糖尿病数据集中，DAESC用于识别胰腺内分泌细胞中患者和对照之间的几种差异调节基因。
图4 克胰腺内分泌细胞中 2 型糖尿病患者和对照组之间的差异 ASE
基因表达的组间差异分析是揭示疾病机制的重要突破口，染色质可及性分析为基因表达差异的调控根源研究提供了新的维度。
10×单细胞ATAC测序技术精准绘制细胞类型特异的开放染色质图谱，帮助发现类似内分泌细胞中差异ASE基因的上游调控机制，为疾病相关通路解析提供表观遗传学证据。
与转录组数据互补，共同锁定疾病关键调控元件，揭示疾病相关基因表达失调的深层原因。
| 三黍服务 | 技术参数 |
当研究目标较为清晰时，可以基于细胞注释结果，挑选与研究目标最相关的细胞类群进行后续分析。
例如在2024年发表于Journal of clinical investagation的巨噬细胞亚群在心脏修复中的作用机制研究中[5]，巨噬细胞作为心脏主要免疫细胞，具有促炎和促修复的双重功能，但其亚群的异质性及作用机制尚不明确。新生儿心脏具有短暂再生能力，而出生后10天及成年后心脏丧失这一能力，巨噬细胞亚群的动态变化可能是关键因素。所以作者对巨噬细胞进行单细胞H3K27ac ChIP - seq和scRNA - seq，分析细胞亚型、功能异质性及相关转录因子和增强子，通过体内外实验验证，揭示其功能和命运决定机制。
图5 巨噬细胞亚群注释和基因功能结果
针对特定细胞类型的机制研究，定制化分析方案可显著提升研究效率。当研究目标明确指向特定细胞类群时，精准的数据挖掘策略尤为关键。
单细胞测序高级分析服务支持个性化流程设计，定制从亚型鉴定到调控网络构建的全套解决方案，助力揭示细胞命运决定的核心机制。
结合表观遗传与转录组数据，系统性解析细胞亚群功能异质性及动态调控网络。
| 三黍服务 | 技术参数 |
当疾病相关的细胞群被筛选到以后，可以对该亚群与其他细胞亚群进行差异基因分析，得到差异基因list后我们则知道该亚群上下调了哪些基因，能帮助我们解释致病的机制或寻找致病的靶点，当然，这需要我们去查询各种基因的背景、功能。
接下来，可以进行功能分析，以进一步寻找致病机制或缩小差异基因的范围。可以从细胞、通路、分子的维度出发。
细胞层面有轨迹分析细胞、相互作用分析等。轨迹分析可以判断聚焦的细胞亚群的来源或去路，紧接着上面的例子，我们可以对各种细胞亚群进行轨迹分析，看看细胞亚群的轨迹变化情况。
细胞相互作用分析可以聚焦感兴趣的核心亚群，看哪些细胞与核心亚群作用变化明显，可直接找到亚群甚至相互作用的表面蛋白。
通路层面则有GO，KEGG，GSEA，IPA等分析，对差异基因进行富集，寻找与疾病相关的信号通路。
分子层面最基本的还是分析差异基因。
此外通过转录因子分析，SCENIC分析可以发现调控基因表达的转录因子，其本身也是蛋白（同样有基因表达），我们可以进一步缩小差异基因的范围。
高效率科研首选，重塑高通量测序体验！
三黍高通量测序重磅上新：宏转录组、全基因组重测序、de novo测序、小RNA测序、全转录组测序、外泌体提取分析……
全线产品已开启内测，欢迎私信或联系您的客户经理领取首批限量预售名额！
[1] Cardenas M A , Prokhnevska N , Sobierajska E ,et al.Author Correction: Differentiation fate of a stem-like CD4 T cell controls immunity to cancer[J]. Nature:1-1[2024-1119].DOI:10.1038/s41586-024-08303-1.
[2] Ma C, Yang C, Peng A,et al. Pan-cancer spatially resolved single-cell analysis reveals the crosstalk between cancer-associated fibroblasts and tumor microenvironment.[J]. Mol Cancer:[2023-08-13]. DOI: 10.1186/s12943-023-01876-x.
[3] Li J, Simmons AJ, Hawkins CV, Chiron S, et al. Identification and multimodal characterization of a specialized epithelial cell type associated with Crohn's disease[J].Nature Communications: [2024-08-22].DOI:10.1038/s41467-024-51580-7.
[4] Qi G , Strober B J , Popp J M ,et al.Single-cell allele-specific expression analysis reveals dynamic and cell-type-specific regulatory effects[J].Nature Communications, 2023, 14(1).DOI:10.1038/s41467-023-42016-9.
[5] Fu M , Jia S , Xu L ,et al.Single-cell multiomic analysis identifies macrophage subpopulations in promoting cardiac repair[J].Journal of Clinical Investigation, 2024, 134(19):20.DOI:10.1172/JCI175297 .
滑动查看更多：
排版：野凌
审核：三黍生物企宣部
