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背景
血红铆钉菇（Chroogomphis rutilus）属于担子菌科，在我国广泛分布，是一种珍贵的药用和食用真菌，已被鉴定含有数十种生物活性化合物，如甾醇类、酚类、香豆素类、核苷类和多糖，且多糖含量丰富，药理活性显著。目前只有水提醇沉（HWE）应用于该多糖的研究，但其产量低且费事费力。目前，超声(UAE)和微波(MAE)因其高效、方便和优越的生物活性而被广泛用作替代技术。此外，最近的研究表明，序次超声微波(UMAE)在提高提取物的产量、减少提取物的降解和改善其功能方面具有潜在的优势，是一种很有吸引力的提取技术，并成功地用于提取多种多糖。但，不同的提取方法可以通过改变多糖的结构性质，包括化学成分、分子量分布、分子构象和形态影响多糖的生物活性。
2021年8月，东北林业大学在International Journal of Biological Macromolecules（IF=5.162）杂志上在线发表了题为“Comparative study of structural properties and biological activities of polysaccharides extracted from Chroogomphus rutilus by four different approaches”的研究论文。该研究首次采用了不同提取方法对血红铆钉菇进行提取，并对多糖的提取效率、理化性质、结构特征、构像、表面形貌以及抗氧化和免疫刺激活性进行了评价。
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研究材料
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1. 不同提取方法的提取效率比较分析
通过四种提取方式对比可得。UMAE的产率最高，时间最短（表1），可能是超声的声空化和机械切割促进了溶剂的渗透和多糖的溶解，破坏了材料基体。此外，独特的微波辐射加热作用可进一步促进多糖的细胞壁深度破裂和扩散。
2. 不同方法提取的生长素的理化性质
四种提取方法的主要化学成分（碳水化合物、硫酸自由基、蛋白质和糖醛酸）无显著差异（表2）。但CRP-U的平均MW最低，可能会导致CRP的降解（图1A）。所有CRP样本单糖类型一致，以葡萄糖为主，甘露糖和半乳糖含量较少，但CRP-H半乳糖含量偏低。相比之下，CRP-M的微波辐照可以通过高温和内部产生的压力使组织迅速破坏，从而缩短提取时间，使多糖热降解的影响最小化。
图1. 不同方法提取的crp的HPSEC色谱图
3. 不同方法提取的CRPs的结构特征
如图1C所示，4个CRP样品呈现平行的红外特征曲线，四种提取方法对crp的糖苷键构型或主要官能团均无明显影响。
甲基化结果表明（表3），主链结果差异不明显，而T-Glcp-(1→、→4)- glcp -(1→、→6)- galp -(1→)的相对摩尔百分比差异显著，这个结果和他们单糖组成的成分分析结果一致。
经分支度（DOB）测定可得（图3），4个样品中， CRP-UM的DOB显著低于其他三种，但其他三个方法引起DOB差异的糖苷键的摩尔百分比有所不同。从机理上看，不同的提取方法可以产生不同程度的分支链的多糖以及不同的糖苷键。
图3. CRPs 的分支度(A). 不同浓度的NaOH 四种提取方法提取的刚果红与CRPs混合物的吸光度值。
NMR研究了不同制备方法对CRP的影响（图4），结果表明CRP-H、CRP-M和CRP-U的13C NMR峰丰度明显高于CRP-UM，说明crp的糖苷连锁比例不同。这些结果与上述单糖组成和甲基化分析结果一致。
图4.四种提取方式的CRP的13C结果图
4. 不同方法提取的crp的构象和微观结构
结果如图3B所示，所有样品均存在三螺旋构象，但是CRP-UM比其他三种更明显，说明提取方法对多糖的构象有显著影响。
电镜结果可知（图5A），四种多糖在形状和大小上存在显著差异。通过AFM观察到，所有crp主要表现为球形和不规则的块体以及分支糖链的缠结（图5BC）。
图5.四种方法提取的CRP的SEM以及AFM结果
5.CRP反应蛋白的还原能力及清除自由基能力
测定了FRAP、手性OH、手性O2−和手性ABTS+清除活性来反应不同方法提取的多糖的活性（图6）。所有的CRP样本均表现出体外抗氧化活性，其中CRP-UM最强，这可能是因为超声波和微波协同作用，提高了多糖的提取效率，减少了多糖的降解。
图6. 四种方法提取的CRPs的还原能力
6. CRP在HL-7702细胞中的抗氧化活性
测定了CRPs其对人肝细胞系HL-7702增殖的影响。结果显示（图7），四种提取方法均剂量依赖型的减轻了细胞的损伤，并且如预期一样的是CRP-UM表现出最有效的活性。而CRP-M对HL-7702细胞的保护作用极为显著，其余两种方法效果不明显，这可能是因为热水以及超声提取破坏了CRP固有的结构特征，从而牺牲了其抗氧化活性。
图7. 四种方法提取的CRPs的抗氧化活性可以改变h2o2诱导的HL-7702细胞氧化损伤。
7. CRP在RAW264.7细胞中的免疫刺激活性
比较了不同CRP样本激活RAW 264.7细胞的能力(图8)。当CRP浓度超过25 μg/mL时，各CRP处理组间的差异显著。并且多糖的活性是多种结构特征共同作用的结果。例如，CRP-H免疫活性最强而抗氧化活性最低，但CRP-UM与之相反。这可能是因为水体过程中的加热使得CRP-H具有较高的分支，温和的分子量以及适度的三螺旋结构，从而提高了CRP与巨噬细胞之间的亲和力。同样，CRP-M相对较大的粒径和柔性链也有助于提高其免疫刺激活性。CRP- m具有较高的产率、抗氧化和免疫刺激能力，表明MAE可以作为一种合适的CRP提取方法。
图8. 四种方法提取的crp对RWA264.7细胞增殖(A)、ROS水平(B)、NO (C)、TNF-α (D)含量的影响。
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小结
本研究考察了HWE、MAE、UAE、UMAE在最佳提取条件下对CRPs提取效率、结构特性、抗氧化和免疫刺激活性的影响。结果表明，UMAE是提取crp最有效的方法。四种方法提取的多糖化学成分、单糖类型和糖苷键相似。然而，提取工艺可以显著改变多分子量、单糖比例、糖苷键比例、分支程度、三螺旋结构以及表型特征。CRP-UM和CRP-H的抗氧化活性和免疫刺激活性不一致。CRP-UM在体外和HL7702细胞中具有最强的抗氧化能力，可能是由于其相对较高的分子量和较强的三螺旋偏好。相反，在活化RAW264.7细胞方面，CRP-H表现出最佳的活性，而CRP-UM表现出最低的活性，这主要是由于高分支度、中等分子量和三螺旋构像。实验结果表明，微波辅助萃取法可以有效地提高CRP反应蛋白的提取率和多糖的生物活性。
