鲜发酵米粉(FFRN)是亚洲国家一种重要的主食。传统的FFRN的生产主要依赖于大米原料和周围环境的微生物，发酵周期长，品控不稳定，且存在一定的安全隐患。已经有研究商业用的发酵剂，但是发酵剂的组成并没有统一的规定。经研究发现，发酵大米浆不同发酵阶段的优势菌为发酵硅乳杆菌，而作为发酵系统中的优势酵母，酿酒酵母菌不但可以分泌胞外酶，而且在发酵过程中可以产生CO2使得面团蓬松且产生各种风味化合物，同时它的成本较为低廉。而发酵乳杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌重组发酵剂用于FFRN的研究鲜有报道。
2022年3月22日，中国农业科学院食品科学技术研究所王凤忠课题组在Food Research International（IF=6.475））杂志上在线发表了题为“Edible qualities, microbial compositions and volatile compounds in fresh fermented rice noodles fermented with different starter cultures”的研究论文。作者通过HS-SPME-GC-MS、HS-GC-IMS和高通量DNA测序技术比较了四种添加发酵剂以及自然发酵的FFRN的蒸煮品质、质地以及微生物组成和挥发性化合物。该项研究在提高了工业生产效率的同时也确保了FFRN的食用安全。
研 究 材 料
植物乳杆菌(L.p)
植物乳杆菌+发酵乳杆菌，命名为(l.f)
植物乳杆菌+酿酒酵母菌(L.p + S.c)
植物乳杆菌+发酵乳杆菌+酿酒酵母菌(l.f f + S.c)
自然发酵（NF）
研 究 结 果
1.1 PH值的变化
研究发现，随着时间的延长，PH均有所降低，且NF组的最高。并且加了乳酸杆菌的PH降低更快，这可能与发酵过程中乳酸杆菌代谢为了乳酸所致。
图1 PH值的变化
1.2 FFRN的烹饪品质和结构特征
与NF组相比，添加发酵剂的4组蒸煮损失和蒸煮水浊度均较低，其中L.pf + S.c组最低。结果表明，发酵剂发酵破坏了淀粉的有序晶体结构，降解了蛋白质和脂质，蛋白质网络对淀粉颗粒的约束会减弱，从而导致淀粉凝胶结构的强化。因此，FFRN的硬度、回弹性、弹性和咀嚼性均有增加的趋势。
表1 五种发酵米粉的蒸煮特性及质构分析(TPA)。
1.3 FFRN微生物学分析
1.3.1 不同FFRN中alpha多样性的变化
经筛选和优化后，15份样本获得了237条细菌OTUs以及692条真菌OTUs. 除NF组外，其他各组Sobs指数均在0 h时最高，与Shannon和Chao指数的变化趋势一致。这说明细菌种类在早期最为丰富，一些原始细菌可能来自水稻或加工环境。这就是为什么自然发酵不能保证FFRN的安全性的原因。NF组的Sobs、Shannon和Chao指数在第一个发酵阶段呈下降趋势，在第二个发酵阶段略有上升，且均高于其他4个添加发酵剂组, 真菌群落丰富度随着时间的延长而降低.
图2 鲜发酵米粉不同发酵阶段微生物α多样性研究
1.3.2 FFRN中的微生物群落
发酵过程中FFRN的微生物组成和多样性变化如图3所示。细菌在门水平的相对丰度如A所示，检测到3个细菌门，包括厚壁菌门、蓝藻菌门和变形菌门。在整个发酵过程中，相较于NF组而言，其余四组的厚壁菌门所占百分比显著提高。B图中展示的是检出的9个属，发酵过程表明，高酸环境可以抑制发酵过程中细菌的生长。而NF组的结果表明，他的细菌组成受环境影响较大，并且其组成多样不可控。因此，添加了乳酸菌的FFRN安全性更佳。
图3 鲜发酵米粉细菌组成的变化
1.3.3 FFRN发酵的异同
韦恩图反应了不同发酵剂培养的FFRN属水平的微生物组成（图4）。共鉴定出43种细菌和78种真菌，其中9种细菌和32种真菌在整个发酵过程中被发现，并且发酵剂的组成在每个组都是独一无二的。通过LDA效应分析可知，自然发酵过程受环境影响较大，其产物中的细菌群落具有多样性和不可控性。
图4 发酵过程中微生物组成的变化及差异分析
1.4 FFRN的风味组学
1.4.1 HS-GC-IMS图谱随发酵时间的变化
采用HS-GC-IMS法对不同发酵剂发酵不同时期FFRN中挥发性成分进行分析。所有样品挥发性成分的三维(3D)地形图如图5A-C所示，其中添加了发酵剂的峰形相似。为了方便观察，取俯瞰图进行进一步比较（图5D-F），0 h时大部分信号出现在停留时间范围100 ~ 800 s之间，漂移时间为1.0 ~ 2.0，而FFRNs在发酵末期的停留时间迅速增加到1200 s。这一结果表明，挥发性物质大量存在。极性化合物在非极性柱上的保留最少，因此它们的保留时间集中在100-200 s。由此可见，在发酵剂中添加酿酒酵母可能有助于极性化合物的形成或减少非极性化合物的种类。
图5 新鲜发酵米粉HS-GC-IMS的地形图(A、B、C)，
地形图(D、E、F)和定性分析地形图(G、H、I)的俯视图
1.4.2不同发酵时间FFRN中挥发性成分的变化
采用长廊图法对不同发酵剂发酵的FFRN挥发物进行指纹图谱分析（表2）。共测量了55种挥发性化合物，包括7种醇、17种醛、8种酮、1种酸、8种酯和11种未识别的化合物。醛是影响发酵大米产品风味的主要化合物。酒精对发酵米粉独特的风味形成起着重要的作用，他可以促进乙醇的产生. 同样，5种FFRN产物中酮的比例也不同，这与发酵剂微生物组成和代谢产物的差异有关。醇类和酯类是发酵产品散发出愉悦风味的重要化合物，如发酵米酒和干发酵香肠。这些结果表明，发酵剂的微生物代谢有利于酯的形成。
表2 GC-IMS法测定了新鲜发酵米粉中42种化合物的相对含量
1.4.3 HS-SPME-GC-MS分析不同发酵时间FFRNs中挥发性组分的变化
采用HS-SPME-GC-MS对发酵0 h和6 h的挥发性成分进行检测，综合了解FFRNs挥发性成分随发酵时间的变化. 与HS-GC-IMS结果相似，随着发酵，大部分挥发性化合物的种类和比例增加，说明添加发酵剂有利于挥发性化合物的形成（表3）。大米制品中主要的风味物质是醛类物质，其阈值一般较低，在低浓度下可以提供草香或果香，但在高浓度下风味较差。
表3 气相色谱-质谱法测定新鲜发酵
米粉中挥发性化合物的相对气味活性值
1.4.4基于PLS-DA的挥发性化合物相似性分析
利用SIMCA软件对5种不同阶段的挥发性化合物进行相似性和差异性分析，根据数据矩阵进行PLS-DA监督方法。该模型的这些结果与GC-IMS五组聚类一开始的结果相似（图6）。这一发现进一步证实了发酵后FFRNs的挥发性谱发生了显著变化，添加菌株悬浮液会深刻影响其挥发性谱。
图6 新鲜发酵米粉发酵过程中挥发性
物质的偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)
1.5 FFRN中主要挥发性成分与风味特征的相关性研究
为了进一步分析挥发性化合物对FFRN风味的贡献，通过GC-IMS和GC-MS仪器获得了rOAV。化合物的rOAV大于1表明这些化合物对风味有重要贡献，rOAV在1到0.1之间的成分被认为对整体风味有作用。FFRN中的大部分挥发性化合物具有相似的香气特征，如大部分的果香、蔬菜香、花香和草香。值得注意的是，大多数挥发性化合物的rROAV在含酿酒酵母菌组别中更高，这表明这些组分的风味更足。综合风味、微生物组成和品质等因素，以L.pf + S.c组为最佳选择。如前所述，添加L.pf + S.c制备的FFRN具有理想的风味和优良的品质。
小 结
本研究表明，与自然发酵相比，添加发酵剂可缩短发酵时间，且添加发酵剂的FFRNs的质地和蒸煮品质优于NF组，尤其是L.p + S.c和l.f + S.c组。此外，发酵剂中发酵菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌在发酵过程中占主导地位，提供了稳定的微生物组成，保证了FFRN的安全性，有利于产生多种挥发性化合物。风味组学共鉴定出115种挥发性化合物，其中HS-GC-IMS鉴定55种，HS-SPME-GC-MS鉴定60种。添加发酵剂基团中的醇、酸、酯和酮大部分在发酵过程中积累，醛随着发酵时间的延长而减少。其中，50种挥发性化合物的rOAV大于0.1，对FFRN的特征风味形成有较大贡献。特别是添加了酿酒酵母组的风味比只添加了乳酸菌的组的风味更丰富。此外，PLS-DA模型表明，不同发酵剂发酵的5种ffnn的挥发性化合物分布占据相对独立的空间，易于区分。综上所述，L.p + S.c组和L.pf + S.c组的FFRN风味更丰富、微生物组成更稳定、品质更优，其中L.pf + S.c组的FFRN综合品质最好。本研究为今后进一步研究FFRN产品的发酵剂奠定了基础。小 结
