炎症是对感染、组织损伤或有害刺激的典型防御反应。但炎症过度会导致慢性疾病的发生和发展。许多疾病与过度炎症反应密切相关，如动脉粥样硬化、肝硬化、糖尿病和癌症等。传统的治疗药物有阿司匹林和糖皮质激素等，但长期使用会导致严重的不良反应。研究表明，天然来源的化合物具有干预炎症性疾病的独特生物活性，例如多酚、类黄酮和多糖。值得注意的是，多糖在保护机体免受炎性细胞因子攻击方面表现出良好的性能。因此，它们被认为是值得进一步研究的抗炎候选物。
近日，湖北中医药大学刘洪涛教授团队在生物大分子领域的国际期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（Top一区）发表了题为“Structural characterization and anti-inflammatory activity of polysaccharides from Astragalus membranaceus”（DOI：10.1016/j.ijbiomac.2023.124386）的研究性论文。该研究使用DEAE-52纤维素和Sephadex G-100柱层析从黄芪中分离出两种新的均一多糖（APS-A1和APS-B1），并通过HPGPC、HPLC、UV-Vis、FT-IR、甲基化分析、GC-MS和NMR光谱等技术对二者进行了结构表征，同时基于LPS诱导的RAW264.7细胞证实了它们的抗炎活性及其作用机制。该研究表明黄芪均一多糖在抗炎方面的潜力，同时揭示了中药黄芪发挥抗炎活性的物质基础。
采用水提醇沉法提取黄芪多糖，选用Sevag法除蛋白、透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤色谱对黄芪多糖进行分离纯化。
综合运用高效凝胶过滤色谱、高效液相色谱、甲基化分析、GC-MS、红外光谱、紫外-可见光谱、核磁共振波谱法等现代仪器分析方法对黄芪多糖纯化组分进行结构表征，确定它们的多糖结构。
基于LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，评估了黄芪均一多糖组分的抗炎活性和药效学机制。
本研究采用热水提取、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、透析、冻干等方法，从蒙古黄芪中提取黄芪多糖（APS），得率为3.29%。APS经DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶柱分离，得到两个均一多糖组分，APS-A1和APS-B1。含量分析表明APS的总糖含量为64.03%，蛋白质含量为9.04%。纯化后的APS-A1总糖含量达到99.48%，为中性多糖。APS-B1总糖为97.51%，糖醛酸含量为1.16%，表明APS-B1为弱酸性多糖。同时，APS-A1和APS-B1中未检测到蛋白质和还原糖。
图1. APS的提取和纯化过程。
综合运用高效凝胶过滤色谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外-可见光谱对均一多糖进行结构表征。结果表明，APS-A1和APS-B1的平均分子量分别为2.62 × 106 Da和4.95 × 106 Da。APS-A1主要由葡萄糖组成，APS-B1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为75.2∶17.3∶19.4。FT-IR光谱展示了APS-A1和APS-B1具有多糖化学键和官能团的特征吸收峰，并证实含有α型糖苷键。紫外-可见光谱表明它们不含核酸和蛋白质，与化学分析的结果一致。
图2. APS-A1和APS-B1的理化性质和光谱分析。
为了进一步获得有关它们结构的信息，通过甲基化和GC-MS鉴定了糖苷键类型。结果显示，APS-A1主要含有T-Glcp、1，4-Glcp和1，4，6-Glcp 3种糖残基，摩尔比为1.87∶9.93∶1.00。APS-B1包含5种残基，分别是1，5-Araf、T-Glcp、1，4-Glcp、1，6-Galp和1，4，6-Glcp残基，摩尔比为0.24∶1.89∶11.08∶1.03∶1.00。
表1. APS-A1和APS-B1的甲基化分析结果
为了进一步解析APS-A1和APS-B1的结构，通过1D-NMR（1H和13C）和2D-NMR（COSY、HSQC和HMBC）进行了分析，并结合甲基化分析结果，推测了它们的可能结构。APS-A1的骨架是1，4-连接的α-Glcp，一些1，4-连接的α-Glcp的O-6处连有α/β-Glcp残基附着在主干上。APS-B1的骨架是1，4-连接的α-Glcp，夹杂着1，5-连接的α-Araf，一些1，4-连接的α-Glcp的O-6处有1，6-连接的α-Galp，这些末端被α/β-Glcp残基取代形成分支。
图3. APS-A1的NMR。
图4. APS-B1的NMR。
图5. APS-A1和APS-B1的化学结构。
基于LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型，进一步研究了黄芪均一多糖的抗炎活性。研究表明APS-A1和APS-B1在体外具有良好的抗炎活性，可以抑制炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和MCP-1）的表达和分泌，其机制是抑制NF-κB和MAPKs（ERK，JNK）信号通路来实现的。
图7. APS-A1和APS-B1对LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3、iNOS、COX-2蛋白表达和MAPK信号通路的抑制作用。
图8. APS-A1和APS-B1对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响。
在本研究中，从黄芪中分离得到两种均一的多糖APS-A1和APS-B1，并对其一级结构进行表征。同时证明二者具有良好的抗炎活性，可以通过抑制NF-κB和MAPK（ERK，JNK）信号通路，抑制炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和MCP-1）的表达和分泌。这些结果表明APS-A1和APS-B1具有良好的抗炎活性，可以作为一种潜在的抗炎补充剂。二者活性的差异可能与其结构特征有关，进一步的研究将集中在它们的生物活性和构效关系上。
文章链接：DOI：10.1016/j.ijbiomac.2023.124386
陈广明，湖北中医药大学药学院2020级中药学硕士，中共党员。目前已发表SCI论文3篇，其中第一作者发表1篇。
刘洪涛，湖北中医药大学基础医学院教授，博士生导师。中国科学院“百人计划”择优支持者，湖北中医药大学领军人才，湖北省高层次人才计划特聘教授，“湖北省政府专项津贴”专家。目前已发表论文70余篇，其中SCI论文50余篇，申报国家发明专利20余项（授权5项），先后主持承担国家十三五重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、湖北省科技厅专项、武汉市科技局应用基础项目、企业合作项目及各类校级项目共计16项，主编学术著作4部。
现任中国医药教育协会微生态与健康教育专业委员会副主任委员、中国医师协会基础与转化医学专业委员会常务委员、中国中西医结合学会科研院所工作委员会常务委员、中国实验动物学会无菌动物专业委员会委员、中国生物工程学会糖专业委员会委员、中国生物工程学会青年委员、中国生物化学与分子生物学脂质与脂蛋白专业委员会青年委员、湖北省药理学会理事、中国生物检测监测产业技术创新战略联盟理事、湖北省生物医学工程学会自然医学与中医药工程专业委员会委员。
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