蛋白质磷酸化修饰在细胞信号转导中有重要作用，是细胞凋亡、炎症、蛋白转运等多种功能的重要翻译后修饰调控方式。目前，磷酸化蛋白的富集技术已经得到了重大进展，但目前磷酸化蛋白的定性和定量检测在准确度、精确度和通量上还有很大的挑战。
293T细胞、小鼠组织
Orbitrap Astral DIA
为了测试Orbitrap Astral质谱分析磷酸肽的性能，作者从HEK239T细胞中富集了色氨酸磷酸肽段，使用Orbitrap Astral质谱仪（图1A）数据依赖采集(DDA)方法进行检测。图1B展示了其中一个肽段的二级质谱图。总的来说，30分钟的nLC-MS/MS DDA共检测了12,327个磷酸化肽段，对应于9,537个磷酸化位点。通过分辨率(图1C)和质量精度(图1D)来研究Astral分析仪的能力，Astral的分辨能力随着m/z值的增加而持续，且在95%的离子质量精度在5ppm以内。
作者又使用30分钟的DIA方法（图2A）分析了250ng色氨酸磷酸肽段，得到29,190个磷酸化位点，随后作者又测试了4m/z的窗口、1ug-50ng的上样量、7-30分钟的液相梯度（图2B-F），不同的处理带来不同的检测结果，总而言之窗口越小、上样量越大，时间越长，得到的磷酸化位点结果越多，准确度越高。
为了说明数据的准确性，作者使用人类和玉米的整合数据库对上述数据进行分析，及对标准肽段进行重分析，FDR值及对于其他位点磷酸化的分析都证明了数据的可靠性。
图1 Orbitrap Astral技术原理和高精度检测
图2 Orbitrap Astral检测293T细胞磷酸化
作者使用EGF处理和对照的HEK239T细胞进行了检测平台的比较，Orbitrap Astral比timsTOF pro多鉴定到了3倍的磷酸化位点（图3A），可以看到Orbitrap Astral对于低丰度的磷酸化肽段检测效果更好，有更宽的动态范围、更好的重复性（图B-E）。通过对照和处理组的差异比较和通路分析结果，虽然鉴定的数量各不相同，但差异都同时指向EGF相关通路（图3F、G）。
图3 Orbitrap Astral与timsTOF pro技术对比
证明了Orbitrap Astral的快速和高灵敏度后，作者计划完成一个小鼠磷酸化位点完整图谱。之前的研究是10天的检测时间鉴定到35,965个磷酸化位点，作者本次实验设计（图4A），收集了小鼠12个不同组织，每个组织分4个组分，每个组分检测15min，整个实验共计12小时完成检测，共鉴定到81,120个磷酸化位点，不同组织的位点从20,000到40,000不等，且磷酸化位点的分布具有组织特异性。（图4B-E）。
图4 Orbitrap Astral检测小鼠组织磷酸化蛋白质组
4. 磷酸化位点在蛋白质序列和结构中的作用及激酶分析
磷酸化位点在蛋白质的序列的结构上有重要作用，作者对磷酸化位点上下游5个氨基酸进行的基序分析，得到了主要的基序序列，比如S/T-P等等（图5A、B）。为了研究这些基序的结构特征，作者使用AlphaFold对81,120个磷酸化位点进行预测，根据置信评分，大部分位点都处于低分区段，说明大部分位点都在蛋白的无序结构（图5C）。
作者使用预测软件，利用合成肽库分析底物序列的特异性（图5D），结果表明一半以上的磷酸化位点被24种/更多的激酶靶向，且不同组织的磷酸化激酶位点具有组织特异性，比如脑部的磷酸化与神经性疾病状态相关（图5E-G）。
图5 小鼠磷酸化位点基序分析和激酶分析
5. 线粒体蛋白的新磷酸化位点
作者为了深入分析，对81,120个磷酸化位点数据与phosphositeplus52的小鼠磷酸化位点数据进行了比较，发现了38,454个新位点，占总位点的53%（图6A），其中线粒体蛋白相关的磷酸化位点最具代表性（图6B、C），且线粒体蛋白的磷酸化具有组织特异性，在肝脏中最表现最突出（图6D）。其中，CPS1的磷酸化位点最多，共40个（图6E），其中22个之前没有报道过（图6F），且不同的位点对应不同的功能和结构特点（图6G、H）。
图6 小鼠组织新磷酸化位点
6. 脑组织磷酸化位点水平动态范围最大
进一步数据分析表明，脑部组织的磷酸化特异性位点最多（图7A），根据Z-score，脑部有9,541个磷酸化位点异常值（图7B），根据排名确定视神经萎缩蛋白1（OPA1）的S298磷酸化位点最重要（图7C）。对该位点进行基序和结构分析，进一步说明该位点对OPA1功能的重要性（图7D-F）。
图7 小鼠脑组织磷酸化分析
由于其在细胞信号转导中的作用，蛋白质磷酸化在无数细胞过程中起着至关重要的作用。本研究使用新型质谱仪（Orbitrap Astral）结合数据独立采集（DIA）来实现对人类和小鼠磷酸化蛋白质组的快速和深入分析。通过这种方法，半小时内绘制了大约30,000个独特的人类磷酸化位点。应用这种方法生成了小鼠的磷酸蛋白质组多组织图谱。在12小时内，总共检测到81,120个独特的磷酸化位点。通过这个独特的数据集，作者研究了蛋白质磷酸化的序列、结构和激酶特异性背景。最后，通过与线粒体和脑生物学相关的新型磷酸化事件的多个例子强调了这一资源的发现潜力。
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排版：野凌
审核：三黍生物企宣部
