覆盆子（Rubus chingii Hu.）作为传统中药，具有益肾固精缩尿、养肝明目等功效。近年来，覆盆子也被报道具有抗氧化、抗炎、降糖减脂的作用。关于覆盆子的功能成分主要集中于酚类、类黄酮、三萜、矿物质、维生素、类胡萝卜素和有机酸等。值得注意的是，植物多糖也具有极好的健康促进作用，比如抗炎、免疫调节、抗肿瘤、减肥、降血糖等。覆盆子多糖目前主要报道具有抗氧化、非酶糖基化抑制、α-淀粉酶抑制和巨噬细胞激活等作用。但是有关覆盆子多糖新成分、新结构和新功能方面的研究较少，而作为极具开发价值的植物多糖应该更加深入的研究和开发。
2023年4月18日，来自温州医科大学药学院郑宏课题组在国际食品TOP期刊Food Chemistry（IF=9.231）上发表了题为“A novel polysaccharide from Rubus chingii Hu unripe fruits: Extraction optimization, structural characterization and amelioration of colonic inflammation and oxidative stress. 2023, 421, 136152”的研究性论文。该研究首先采用三步法优化了从未成熟覆盆子果实中提取多糖的工艺条件，并通过单糖分析、FT-IR、分子量及均一性分析、甲基化分析和1D/2D NMR分析对多糖主要组成成分（pRCP）进行了详细的结构表征。随后，对高脂饮食小鼠进行为期12周的干预实验，并分析其对肠道菌群、结肠炎症和氧化应激的影响。最后，将pRCP处理小鼠的肠道微生物群移植给高脂饮食喂养的受体小鼠中，以确认肠道微生物群在pRCP对肠道保护作用中的因果作用。该研究结果表明覆盆子新型多糖pRCP可以作为一种潜在的益生元，通过调节肠道微生态平衡来改善肠道炎症和氧化损伤，保护肠功能健康。
采用水提醇沉法提取覆盆子多糖，选用Sevag法除蛋白、透析脱盐、阴离子交换层析和凝胶过滤色谱进行分离纯化。
利用高效凝胶过滤色谱、高效液相色谱、FT-IR分析、甲基化分析、核磁共振波谱法等多种技术手段对覆盆子多糖进行结构解析。
通过对高脂饮食小鼠进行覆盆子多糖干预以及粪菌移植实验，揭示覆盆子多糖通过调控肠道菌群来改善结肠炎症和氧化应激。
本研究首先采用最优提取方法（超声辅助乙醇浸提法）提取覆盆子粗多糖（RCP）（图1a），并通过三步法对超声辅助预处理过程进行了优化（图1c），RCP的提取率可达8.30±0.07%，显著高于非优化提取方法（图1b）。RCP经DEAE Seplife FF纤维素色谱柱和Sephacryl S‑400HR色谱柱分离，得到纯度为86.03%的覆盆子多糖pRCP（图2a、2b）。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定多糖和蛋白质含量，结果显示pRCP中多糖含量达44.61％，未检测到蛋白质（表1）。
图1. RCP的提取过程。
利用高效凝胶过滤色谱、高效液相色谱、FT-IR对多糖进行结构表征。如表1所示，pRCP的单糖组成及比例为：岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸=0.35：39.76：39.43：2.16：1.53：2.56：8.56：5.64。FT-IR光谱分析表明pRCP具有多糖的特征吸收峰（图2c）。在不同的放大倍数下，用SEM检测了pRCP的表面形貌，发现pRCP具有光滑的表面和多孔的层状结构，表明pRCP可以用作药物递送的包封材料（图2d）。
图2. pRCP的纯化过程、FT-IR分析以及电镜扫描分析。
表1. RCP多糖产率以及单糖组成
进一步通过甲基化分析确定了pRCP中的糖苷键和糖残基的摩尔百分比。如表2所示，t-Ara(f)、3-Ara(f)、5Ara(f)和2,5- Ara (f)的摩尔百分比分别为23.059、2.997、11.156和2.446%。pRCP的主要糖苷键为t-Gal (p)、3- Gal (p)、4-Gal(p)、6-Gal(p)和3,6- Gal (p)，比例分别为3.477、4.362、5.367、5.782和18.344%。此外，pRCP还由t-Gal(p)-UA和4-Gal(p)-UA组成，其百分比分别为0.386和8.051%。由此可见，pRCP富含阿拉伯糖和半乳糖的糖残基，与单糖组成分析一致。
表2. pRCP的甲基化和键合类型分析
随后，1D/2D NMR进一步分析pRCP的结构（图3a-3f），综合甲基化分析结果，推断pRCP主要是由→3,6)‑β‑Galp(1→和→5)‑α‑Araf(1→形成主链，支链主要由α‑Araf(1→连接在残基B的3位构成。
图3. pRCP的结构表征。
为了研究pRCP干预对高脂饮食（HFD）小鼠肠道菌群的影响，给予小鼠正常饲料（Chow）、HFD或HFD+pRCP，为期12周（图4a）。结果显示，pRCP干预显著增加肠道微生物多样性（图4b）并且明显改变HFD小鼠的肠道微生物整体模式（图4c）。随后，通过火山图和韦恩图分析鉴定7个菌属在HFD小鼠中显著变化且pRCP干预后也被显著调控（图4d-4f）。运用热图展示这7个菌属的变化，如图4g所示，与Chow小鼠相比，HFD小鼠的Erysipelatoclostridium和Negativibacillus的相对丰度显著增加，但经过pRCP干预后，它们的丰度显著下降。因此，pRCP可以作为一种潜在的益生元，增加HFD小鼠的肠道微生物多样性，降低有害细菌的丰度。
为了研究pRCP干预对HFD导致的结肠炎症和氧化应激的影响，本研究分析了pRCP干预后HFD小鼠结肠中的相关炎症和氧化应激指标。qPCR结果显示，HFD可显著增加小鼠结肠中IL-6（图5a）、IL-1β（图5b）和TNF-α（图5c）的表达水平，但经pRCP干预后，其表达水平显著降低。与Chow小鼠相比，HFD小鼠的结肠抗氧化应激指标Sod1（图5d）、Nqol（图5e）和Nrf2（图5f）表达水平显著降低，pRCP干预后可使其恢复到正常水平。另外，pRCP干预可显著降低HFD小鼠的结肠促氧化应激指标Acox1（图5g）和Nox2（图5h）mRNA表达水平。对于Nox4，与其他两组相比，pRCP组有轻微但不显著的降低（图5i）。之后，采用免疫组化染色法测定小鼠结肠中DNA氧化损伤生物标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHDG）和氧化应激生物标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）的蛋白水平变化，如图5j和图5l所示。定量结果显示，HFD小鼠结肠中8-OHDG（图5k）和4-HNE（图5m）阳性染色强度均显著增加，经pRCP干预后恢复到正常水平。综上所述，研究结果表明，pRCP具有减轻HFD诱导的小鼠结肠炎症和氧化损伤的能力。
图4. pRCP重塑HFD小鼠的肠道菌群。
图5. pRCP减轻HFD小鼠结肠炎症和氧化应激。
随后，我们采用粪菌移植实验进一步验证pRCP通过改变肠道菌群对HFD导致的结肠疾病保护作用中的因果关系，如图6a所示，其中HFD-R小鼠移植HFD小鼠粪菌，pRCP-R小鼠移植pRCP干预小鼠粪菌。结果显示，与HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠肠道微生物多样性明显增加（图6b）。PCoA结果显示，pRCP-R小鼠的肠道微生物模式与HFD-R小鼠的肠道微生物模式明显分离（图6c）。随后，通过火山图，鉴定出HFD-R和pRCP-R小鼠之间显著变化的肠道微生物（图6d）。结果发现pRCP-R小鼠中Erysipelatoclostridium和Negativibacillus的相对丰度明显低于HFD-R小鼠。
同样地，通过qPCR检测小鼠结肠组织的炎症和氧化应激相关基因mRNA水平表达情况。结果显示，与HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠结肠中炎症因子的表达水平显著降低，包括IL-6（图7a）、IL-1β（图7b）和TNF-α（图7c）。与HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠结肠中Sod1（图7d）和Nqo1（图7e）水平略有升高，但不显著。但是，pRCP-R小鼠的Nrf2水平明显高于HFD-R小鼠（图7f）。此外，pRCP-R小鼠结肠中Acox1（图7g）、Nox2（图7h）和Nox4（图7i）的表达水平明显低于HFD-R小鼠。免疫组化染色进一步证实了这些结果，与HFD-R小鼠相比，pRCP-R小鼠结肠中8-OHDG（图7j-7k）和4-HNE（图71-7m）阳性染色强度显著降低。因此，研究结果表明pRCP可以通过调控肠道菌群来改善结肠炎症和氧化损伤。
图6. FMT改变了HFD小鼠的肠道微生物群。
图7. FMT可减少HFD小鼠的结肠炎症和氧化应激。
本研究采用三步法优化了从未成熟覆盆子果实中提取多糖的工艺条件，并对多糖主要组成成分（pRCP）进行了详细的结构表征。报道了pRCP是一种由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成的多键酸性杂多糖，其主链由→3,6)-β-Galp(1→和→5)a-Araf(1→组成。pRCP表现出较高的均一性，其Mw和Mn分别为74.864和49.187 kDa。此外，发现pRCP干预可以增加HFD小鼠的肠道微生物多样性，降低有害细菌的丰度。同时，不管是对高脂饮食小鼠进行覆盆子多糖干预还是粪菌移植实验均可减轻HFD诱导的小鼠结肠炎症和氧化应激。因此，pRCP有望作为一种有前景的益生元用于改善HFD引起的肠道微生态失调以及结肠炎症和氧化损伤。
文章链接：DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.136152
罗浛绮，温州医科大学药学院2021级药学硕士，研究方向：覆盆子多糖优化制备及其对肠道稳态作用机制研究，目前以第一作者在Food Chemistry、Journal of Proteome Research等SCI期刊发表论文2篇，申请覆盆子多糖相关国家发明专利2项。
郑宏，博士，温州医科大学药学院副研究员，博士生导师。目前主要从事糖尿病及其并发症/合并症的发病机制和防治策略研究，具体包括菌群失调和代谢紊乱在糖尿病及其并发症/合并症中的作用机制研究以及糖尿病功能性食品开发与运用。截止目前已在Microbiome, Journal of Advanced Research，mSystems，Food Chemistry等国内外相关领域期刊发表论文70余篇，其中第一或通讯作者论文40余篇，引用超过1800余次，H指数28；授权国家发明专利3项；主持国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年项目、浙江省公益技术应用研究项目等基金项目7项；作为主要完成人获得浙江省科技进步奖二等奖、浙江省中医药科学技术奖二等奖等科技奖项3项；入选浙江省“钱江人才计划”、温州市科技创新青年拔尖人才等人才项目；指导本科生或研究生获得国家奖学金、挑战杯省赛金奖、互联网+省赛金奖、全国生命科学竞赛二等奖等奖项。
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