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作者首先培养了三种乐伐替尼耐药HCC细胞系（Huh7-LR、PLC/PRF/5-LR和Hep3B-LR），结果表明，耐受细胞株的乐伐替尼敏感性较低，且与它亲代细胞相比，细胞形态上表现出拉长的纺锤形（图1A-C）。通过蛋白质组学检测后发现，相比于非耐药亲代细胞，两个关键的tRNA m7G甲基转移酶复合物成分（METTL1和WDR4）在耐药HCC细胞中显著上调，WB结果也证实了该结果，相对应的，耐药细胞中的tRNA m7G修饰水平也升高（图1D-E）。

随后，通过HCC患者的器官模型评估，作者发现大多数器官对乐伐替尼治疗表现出耐药性，而只有少数器官对仑伐替尼表现出敏感性（图1F-G），且对乐伐替尼耐药的HCC器官具有较高的METTL1和WDR4的表达水平（图1H），HCC患者队列的检测表面，耐药性患者体内METTL1和WDR4的表达也上调了（图1I）。与METTL1或WDR4表达水平高的患者相比，表达水平低的患者预后更好（图1J-M）。

上述结果证实了METTL1和WDR4可能在乐伐替尼耐药方面发挥重要作用。

图1 METTL1和m7G tRNA修饰在乐伐替尼耐药细胞中上调

为了进一步证实METTL1作用，作者构建了METTL1敲低Huh7-LR、PLC/PRF/5-LR、Hep3B-LR细胞株，敲低细胞对乐伐替尼的敏感性有所回复，导致增殖能力受损（图2B-C），存活克隆减少（图2D-E），凋亡比例增加（图2F-I）。为了研究METTL1是否通过tRNA m7G修饰来调节仑伐替尼的耐药性，作者在对乐伐替尼先天敏感的亲本Huh7细胞中过量表达了野生型METTL1和其催化无活性突变体，Northwestern blot结果表明，相比无活性突变体，野生型METTL1的过表达增加了tRNAs中的m7G修饰水平（图2J）、Huh7细胞对乐伐替尼的耐药性、殖能力（图2K）及存活的克隆数（图2L），同时减少了凋亡比例（图2M-N）。

上述结果表明， METTL1以酶活性依赖的方式促进了乐伐替尼耐药表型。

图2 METTL1通过酶促方式诱导肝癌细胞对乐伐替尼的耐药

TRAC-seq数据显示，乐伐替尼耐药细胞中共有15个tRNAs含有m7G修饰，已确定的m7G修饰的tRNAs的信号在耐药细胞中被上调（图3B），同时也观察到m7G修饰的tRNAs的表达水平增加（图3C-D）。由于tRNA是翻译必须的，作者随后检测了样本内蛋白翻译情况，普罗米辛摄取实验显示，耐药细胞中的全局蛋白新合成增加，并随着METTL1敲低而减少（图3E-F）。此外多核糖体分析也显示，两种乐伐替尼耐药细胞中多糖体峰值增加（图3G-H），进一步支持耐药细胞中全局mRNA翻译被上调的发现。且METTL1敲低后，峰值也被降低（图3I-J）。此外，过表达野生型METTL1而不是催化无活性的METTL1能促进全局蛋白新合成（图3K）。

这些数据表明乐伐替尼耐药细胞的全局mRNA翻译增加主要是由METTL1通过酶依赖方式介导的。

图3 METTL1是乐伐替尼耐药细胞中翻译活性上调所必需的

在乐瓦替尼耐药细胞中降低METTL1后，有3921个mRNA的翻译效率下降（图4A）。翻译效率降低的mRNA具有更高的m7G修饰的tRNA解码密码子的频率（图4B），表明METTL1介导的m7G tRNA修饰以密码子频率依赖的机制调节靶mRNA翻译。通过GSEA对翻译效率变低的mRNA进行通路富集情况后发现，表皮生长因子（EGFR）途径的编码序列（CDS）长度较长（图4D），与m7G相关的密码子较多（图4E），此外，在EGFR途径中翻译效率下降的mRNA中，EGFR mRNA具有最丰富的m7G相关密码子（图4F），进一步的qPCR实验证明，表皮生长因子受体mRNA的翻译效率在两种乐伐替尼耐药细胞中都是上调的（图4G-H）。后续实验结果显示，与亲代细胞相比，乐伐替尼耐药细胞中的EGFR mRNA从单体部分转移到多体部分（图4I-J），METTL1沉默时，EGFR mRNA的翻译效率下降（图4K-N），且乐伐替尼耐受细胞中的EGFR蛋白表达水平及其下游靶点的磷酸化水平被上调，但在METTL1敲低后则有所下降，活性实验表明是野生型METTL1在起作用（图4O-Q）。

上述数据表明，METTL1的缺失可以破坏EGFR的翻译，抑制耐药性相关途径的活性。

图4 METTL1促进EGFR的翻译效率

在METTL1抑制细胞中过表达EGFR后，耐药表型部分回复，表现为在乐伐替尼存在时提高细胞增殖能力和克隆能力（图5A-C），降低细胞凋亡比例（图5D-E）。与之相对应的是，在抑制METTL1过表达的细胞中的EGFR后，可部分挽救乐伐替尼的敏感性（图5F-J）。

上述结果表明， EGFR途径在METTL1介导的乐伐替尼耐药性中起着关键作用。

图5 METTLI介导的m7G tRNA修饰通过EGFR诱导乐伐替尼耐药性

为了验证METTL1在体内的作用，作者构建了肝癌发生模型，其中myr-AKT1和N-RasV12原癌基因被睡美人（Sleepy Beauty，SB）转座酶通过水动力转染稳定地整合到肝细胞的基因组中，诱导HCC肿瘤发生（图6A）。小鼠被分为4组，空载组（myr-AKT1/N-RasV12/空载体质粒/SB），有或没有乐伐替尼治疗；METTL1过表达组（myr-AKT1/N-RasV12/Mettl1/SB），有或没有乐伐替尼治疗。

空载组中，乐伐替尼治疗减少了肿瘤负担，表现为腹部大小（图6B）和肝脏肿瘤病灶（图6C）的减少，以及肝脏重量（图6D）和肝脏重量与体重的比率的降低（图6E），而在METTL1过表达组中，乐伐替尼并无显著作用。HE和IHC的检测结果也显示，在空载组中，乐伐替尼治疗导致肿瘤密度的降低，并伴随着较低的Ki67阳性细胞和EGFR表达水平，然而，METTL1过表达后，上述标志物在乐伐替尼治疗下保持不变（图6F-G）。

上述数据表明，METTL1在诱导体内乐伐替尼耐药性方面起关键作用。

图6 METTL1的过表达促进乐伐替尼在体内的耐药

在这项研究中，作者通过体外和体内实验，发现了METTL1介导的tRNA m7G修饰通过促进EGFR通路基因的翻译效率诱导HCC细胞乐伐替尼耐药，揭示了HCC乐伐替尼耐药的新机制，并为靶向tRNA甲基化机制来克服HCC中乐伐替尼耐药提供了强有力的科学依据。